Construtos optogenéticos entregues por via via permitem a caracterização eletrofisiológica detalhada da fisiologia e plasticidade de sinapses específicas em cortes cerebrais agudos. As principais vantagens de ativar as sinapses optogeneticamente é a capacidade de estudar vias de longo alcance e a estimulação seletiva de axônios que não são anatomicamente separados. Demonstrando o procedimento estará a Dra. Lisa Kinnavane, pesquisadora associada do nosso laboratório.
Para começar, carregue uma seringa Hamilton em uma bomba de seringa de microinjeção presa a um braço móvel montado em uma estrutura estereotáxica. Em seguida, coloque uma alíquota de cinco microlitros do vírus em uma microcentrífuga. Gire o tubo por alguns segundos e pipete dois microlitros da preparação viral na tampa do tubo.
Para encher a seringa com a preparação viral, veja a ponta da agulha com um microscópio cirúrgico. Em seguida, coloque manualmente o bolo do vírus na ponta da agulha e retire o êmbolo da seringa usando os controles da bomba. Defina o volume de injeção da bomba para 300 nanolitros e a taxa de fluxo para 100 nanolitros por minuto.
Execute a bomba e confirme o fluxo adequado observando a gota do vírus na ponta da agulha. Absorva o vírus em um cotonete e limpe a agulha com etanol a 70%. Em seguida, usando os parafusos ajustadores no quadro estereotáxico, navegue pela ponta da agulha até o bregma e tome nota das medidas estereotáxicas observadas nas três escalas vernier no quadro.
Adicione ou subtraia essas distâncias das coordenadas do bregma. Faça um furo de rebarba na superfície do crânio usando uma micro-broca montada no braço estereotáxico. Insira a agulha no cérebro na coordenada dorsoventral predeterminada e infunda um volume predeterminado da preparação viral.
Após a perfusão, deixe a agulha in situ durante 10 minutos para permitir a difusão do bolo. Em seguida, remova a agulha e execute a bomba para garantir que a agulha não esteja bloqueada. Duas semanas após a injeção viral, eutanasie o rato, disseque rapidamente todo o cérebro e transfira-o para a solução de corte de sacarose.
Usando uma colher de chá de metal, pegue o cérebro, descarte o excesso de solução e coloque-o em um papel de filtro. Usando um bisturi, remova o cerebelo e corte o cérebro no plano coronal aproximadamente na metade do seu comprimento. A metade posterior é o bloqueio tecidual LEC.
Devolva o bloco de tecido e o cérebro restante para a solução de corte de sacarose. Em seguida, coloque uma gota de cola de cianoacrilato em um palco de vibratome e espalhe-a em uma camada fina. Em seguida, usando uma colher de chá, pegue o bloco de tecido LEC e transfira-o para o adesivo, de modo que o corte coronal anterior tenha aderido.
Instale o estágio na câmara de tecido vibratório e despeje rapidamente uma solução de corte de sacarose suficiente para submergir o tecido. Depois de orientar a superfície ventral do bloco de tecido em direção à lâmina, corte fatias de 350 micrômetros de espessura do ventral para o dorsal usando uma velocidade lenta de avanço da lâmina. Normalmente, sete fatias podem ser obtidas por hemisfério.
Transfira as fatias para a câmara de coleta de fatias. Em seguida, coloque a câmara de coleta em banho-maria de 34 graus Celsius por uma hora antes de retornar à temperatura ambiente. Coloque o restante do cérebro em paraformaldeído por 48 horas.
Para a identificação da célula-alvo, coloque a fatia na câmara de gravação e imobilize-a usando uma âncora de fatia. Sob baixa ampliação, usando iluminação infravermelha, navegue até a camada cinco do LEC. Em seguida, mude para o objetivo de imersão em água de alta ampliação e identifique os neurônios piramidais.
Marque a posição da célula no monitor com fita adesiva. Em seguida, para formar uma braçadeira de remendo celular inteiro, fabrique uma micropipeta de vidro de borossilicato e preencha-a com uma solução de gravação intracelular. Coloque a micropipeta cheia no suporte do eletrodo e aplique pressão positiva soprando com força em um bocal conectado à porta lateral do suporte do eletrodo.
Levante a objetiva do microscópio de tal forma que um menisco se forme e insira o eletrodo no menisco até que ele possa ser visto no microscópio. Abra a janela Teste de vedação e determine se a resistência da pipeta é de três a cinco megaohms. Em seguida, toque a célula identificada com uma ponta de pipeta, resultando em um recuo na membrana celular.
Em seguida, aplique pressão negativa por sucção no bocal, aumentando a resistência da pipeta. Continue aplicando pressão negativa gradualmente até que a membrana celular se rompa, resultando em transientes de capacitância de célula inteira. Para entrar na configuração atual da braçadeira, use um LED montado direcionado para o caminho da luz do microscópio com cubos de filtro e óptica apropriada e aplique pulsos de luz à fatia através da objetiva de 40X.
Forneça trens de múltiplos pulsos de luz a cinco hertz, 10 hertz e 20 hertz para investigar as propriedades de liberação pré-sináptica. Para permitir que a biocitina preencha o neurônio, aguarde pelo menos 15 minutos depois de entrar em toda a configuração celular. Na braçadeira de tensão, monitore a capacitância da membrana e a resistência de entrada.
Em seguida, retire lentamente a pipeta ao longo do ângulo de aproximação para longe do somatório da célula, observando o lento desaparecimento dos transientes de capacitância e da corrente de membrana, indicando a reselagem da membrana celular e a formação de um remendo externo na ponta da pipeta. Coloque a fatia em paraformaldeído em uma placa de 24 poços e incube durante a noite. Usando o meio OCT, prenda um bloco de tecido ao disco da amostra de criostato.
Para congelar o tecido, coloque o isopentano num recipiente apropriado e submerja o disco da amostra, garantindo que o tecido está acima do nível do isopentano. Em seguida, abaixe o recipiente de isopentano em nitrogênio líquido e deixe o tecido congelar. Uma vez que o tecido esteja completamente congelado, deixe o bloco de tecido na câmara de criostato a menos 20 graus Celsius por 30 minutos para permitir que a temperatura do bloco se equilibre.
Após o equilíbrio, corte seções de 40 micrômetros de espessura no criostático e use um pincel fino para guiar as seções da lâmina. Aderir estas secções congeladas a uma lâmina de microscópio de vidro revestido de poli-L-lisina à temperatura ambiente, tocando a lâmina nas secções. Depois de adicionar 150 microlitros de meio de montagem a cada lâmina, aplique o deslizamento da tampa e remova as bolhas de ar pressionando suavemente o deslizamento da tampa.
Cubra as lâminas para proteger contra o fotobranqueamento e deixe-as secar ao ar por 12 horas. Em seguida, usando um microscópio de fluorescência, examine a localização do local da injeção viral. Para a coloração com biocitotina, incubar as fatias em peróxido de hidrogênio a 3% em PBS por 30 minutos para bloquear qualquer atividade endógena da peroxidase.
Em seguida, lave as fatias cerebrais com PBS até que não haja mais bolhas de oxigênio visíveis. Em seguida, incubar os cortes por três horas em solução complexa HRP biotinilada a 1% de avidina em PBS contendo 0,1%Triton X-100. Após seis lavagens de PBS, incubar cada fatia em solução de DAB até que a coloração de biocitina das estruturas neuronais se torne visível.
Pare a reação transferindo as fatias em PBS frio. Em seguida, monte as fatias nas lâminas do microscópio de vidro usando um pincel. Depois de remover o excesso de PBS, adicione o meio de montagem.
Cubra as fatias usando folhas de cobertura e deixe-as secar ao ar, como demonstrado anteriormente. Uma célula piramidal saudável foi localizada e remendada. Se a identificação de células pós-sinápticas for necessária, uma célula que expresse o marcador fluorescente deve ser localizada usando óptica de campo amplo.
Pulsos de luz simples de dois milissegundos resultaram em potenciais pós-sinápticos excitatórios optogenéticos de forma de onda simples. A plasticidade de curto prazo da sinapse é examinada pela aplicação de cinco trens de 10 e 20 hertz de estimulação luminosa. Ao investigar a plasticidade a longo prazo, a adição do agonista colinérgico carbachol ao aCSF circulante por 10 minutos causou uma depressão a longo prazo que ainda era evidente 40 minutos após a remoção do ligante.
O comprimento do local de injeção foi examinado histologicamente. O repórter fluorescente mCherry foi localizado nas camadas mais profundas do córtex pré-límbico e infralímbico. Além disso, a coloração de uma célula cheia de biocitina confirmou sua localização e morfologia.
As etapas críticas deste protocolo são a transdução precisa da região aferente do cérebro, que pode ser verificada post hoc, e a dissecção rápida do cérebro ao preparar fatias agudas. Este procedimento é facilmente combinado com a marcação fluorescente de um tipo de célula individual, como uma subclasse de interneurônios em particular. Para fazer isso, usaríamos um animal transgênico que expressa uma recombinase nesse tipo específico de célula.
As construções optogenéticas entregues Viralmente permitiram avanços rápidos nos campos da neurociência de sistemas e circuitos.
