O ensaio baseado em microscopia para estudar e analisar os endossomos de reciclagem utilizando o tráfico snare. São melanócitos de pele. As organelas de cor negra que você vê dentro das células são chamadas de melanomas.
Os melanomas são conhecidos como uma classe de organelas chamadas organelas relacionadas ao lysozome ou LRO. Endosósias de reciclagem são organelas vesiculares tubulares de endossoes precoces ou de triagem em todos os tipos de células. Essas organelas desempenham um papel fundamental na biogênese dos melanósimos, uma organela relacionada ao lysozome produzida por melanócitos.
Os endosários de reciclagem fornecem a carga específica de melanócitos para melanomas prematuros durante sua formação. a geração de endossóis de reciclagem observados em várias síndromes são células na hiperpigmentação da pele, cabelo e olho. Portanto, estudar a dinâmica da reciclagem de endósmosos é útil para entender a função dessas organelas em condições normais e de doenças.
Este estudo tem como objetivo medir a dinâmica dos endósmosos de reciclagem utilizando a sintaxe SNARE-13. O primeiro passo é a semeadura de melanócitos de rato em tampas pré-tratadas. Cubra as tampas de vidro na placa de Petri no meio da matriz de membrana do porão.
E seque-o na capa da cultura tecidual por 15 minutos. Lave as tampas uma vez com 1X PBS antes de usar. Semear as células da membrana do porão com coberturas revestidas médias de 50 a 60%.
Adicione sempre 200 nanomolars de PMA à suspensão de células banhadas em mídia RPMI completa. Após semear as células, incubar o prato contendo células na incubadora de CO2 por 12 a 24 horas. O segundo passo é a transfecção de células com plasmídeos de sintaxin-13.
Incubar as pontas contendo DNA e reagente de transfecção, misture por cinco minutos e misture sem a pipetação repetida. Toque o tubo com a cada dez minutos por 30 minutos em temperatura ambiente. Durante a incubação, lave as células duas vezes com 1X PBS, uma vez com OPTI-MEM, e depois adicione 1 mil de OPTI-MEM às células.
Após 30 minutos de incubação, adicione a mistura de DNA do reagente transfecção às células de forma em gota, cobrindo o prato. Incubar as células a 37 graus Celsius por seis horas. Aspire o meio OPTI-MEM com reagente de transfecção e adicione meio RPMI completo complementado com 200 nanomolars de PMA.
Incubar as células a 37 graus Celsius por 48 horas. O terceiro passo é a fixação das células. Por favor, note que o procedimento a seguir é realizado fora da capa da cultura tecidual.
Após 48 horas de transfecção, lave as células duas vezes com 1X PBS e, em seguida, fixe as células com 3% de formaldeído por 30 minutos. Após a fixação, lave as células duas vezes com 1X PBS e armazene as tampas em 1X PBS até usar mais. Alternativamente, as células podem ser montadas em placas de vidro ou armazenadas a quatro graus Celsius.
O quarto passo é a imunostenção das células. Prepare uma câmara úmida. Coloque o pedaço de corte de parafilm em um papel filtro de mouse em uma placa de Petri.
Cubra com papel alumínio. Prepare 25 microliters de solução primária de anticorpos. Adicione anticorpos a uma diluição de 1 a 200.
Adicione esta solução como uma gota no parafilme na câmara úmida. Levante cuidadosamente a mancha de cobertura com fórceps. Inverta-o na gota da solução primária de coloração de anticorpos e cubra a tampa da câmara úmida.
Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Da mesma forma, prepare a solução de anticorpos secundários em uma diluição de 1 a 500 e coloque-a no parafilme ao lado do deslizamento de tampas na câmara úmida. Para colorir o núcleo, adicione DAPI em uma diluição de 120.000 a 130.000 à solução.
Usando fórceps, pegue cuidadosamente o deslizamento de tampas da solução de anticorpos primário e mergulhe-o duas vezes em 1X PBS. Toque na tampa no papel de tecido para remover o excesso de PBS na tampa. Coloque-a sobre a solução secundária de coloração de anticorpos na câmara úmida e não exponha à luz, devido à presença de anticorpos fluorescentes tingidos na solução.
Após a incubação, pegue cuidadosamente o deslizamento de tampas da solução de anticorpos secundários e, em seguida, mergulhe-o duas vezes em 1X PBS. Além disso, toque a mancha de cobertura no papel de tecido para remover o excesso de PBS na tampa. Coloque 12 microliters de reagente de imagem em um slide de vidro e coloque cuidadosamente o deslizamento de tampas manchadas no reagente de montagem.
Inverta o deslizamento de vidro no papel do tecido e, em seguida, pressione suavemente. Em seguida, imagem o deslizamento de tampa usando um microscópio de fluorescência e analisar as imagens usando ImageJ. O sexto passo é a quantificação da sobreposição entre a reciclagem de proteínas localizadas e melanomas.
Quantificação da sintaxe-13 delta-129 colocalização com os melanomas. A microscopia de imunofluorescência de sintaxe-13 em melanócitos do tipo selvagem do rato mostrou GFP-syntaxina-13 tipo selvagem localizado como estruturas vesiculares e tubulares. E a GFP-sintaxe-13 delta-129 localiza estruturas semelhantes a anéis, além da superfície celular.
Além disso, o anel intracelular GFP-syntaxina-13 delta-129 mostrou colocalização com a proteína melanósia TYRP1 em melanosomes com imagem de campo brilhante. Como mostrado anteriormente, uma coorte de GFP-sintaxe superexpressa-tipo selvagem é observada em melanomas. Para medir a localização relativa do tipo selvagem GFP-sintaxin-13 e GFP-syntaxina-13 delta-129 para melanomas, o software Fiji foi utilizado e a análise foi feita com plugin JACOP.
O coeficiente de sobreposição de Mander medido, que é MOC, entre gfp-sintaxe-13 delta-129 com TYRP1 é aproximadamente 1,5 dobras maior em comparação com gfp-sintaxe-13 tipo selvagem com TYRP1. Curiosamente, o TYRP1 mostrou 2,9 dobras mais altas de valores MOC com gfp-sintaxe-13 delta-129 em comparação com gfp-sintaxe-13 tipo selvagem. Esses dados indicam que a localização de melanósias delta-129 delta-129 de GFP é relativamente maior em comparação com o tipo selvagem GFP-syntaxin-13 em um estado estável.
Quantificação da sintaxe-13 localização do tipo selvagem dos endosses reciclados. A microscopia de imunofluorescência do tipo selvagem GFP-sintaxe-13 mostrou colocalização com a conhecida proteína endossomal de reciclagem Rab11. O MOC entre gfp-sintaxe-13 tipo selvagem com mCherry-Rab11 é aproximadamente 1,4 dobras maior em comparação com mCherry-Rab11 com GFP-sintaxe-13 tipo selvagem.
Para medir o número e o comprimento dos túbulos endosomais positivos do tipo selvagem GFP-sintaxe-13, o software Fiji foi usado como descrito na seção de protocolo. MCherry-Rab11 é usado um controle positivo nos experimentos. Os melanócitos transfectados com gfp-sintaxe-13 tipo selvagem mostraram um maior número de túbulos por célula em comparação com células expressando mCherry-Rab11.
No entanto, os túbulos são reduzidos após a coexpressão tanto do tipo selvagem GFP-sintaxe-13 quanto do mCherry-Rab11 nas células. O sétimo passo é a quantificação do número e comprimento tubulares de reciclagem de endossóis. Os túbulos são reduzidos após a coexpressão tanto do tipo selvagem GFP-sintaxe-13 quanto do mCherry-Rab11 nas células.
Curiosamente, o comprimento médio do túbulo tanto do tipo selvagem GFP-syntaxina-13 quanto do mCherry-Rab11 é comparável entre si em células expressas individualmente ou juntas. Juntos, esses dados sugerem que o tipo selvagem GFP-sintaxe-13 localiza-se para a reciclagem de endósmos como semelhante ao Rab11. Este estudo mostrou que a entrega do N-terminal de sintaxe-13 mutante, que é GFP-syntaxin-13 delta-129, localiza-se a melanósias GFP-sintaxe-13 delta-129 pode possivelmente ser usada como repórter para o tráfico vesicular da reciclagem de endosários para a superfície celular e LRO.
Em contraste, o tipo selvagem GFP-sintaxin-13 localiza-se para a reciclagem de endossóis semelhantes ao Rab11. Este estudo ilustrou que o tipo selvagem GFP-sintaxe-13 também poderia ser usado para marcar endossários de reciclagem em melanócitos. GFP-sintaxe-13 tipo selvagem pode ser um melhor marcador endosomal de reciclagem do que Rab11, uma vez que Rab11 altera a dinâmica endossomal.
Ao todo, o tipo selvagem GFP-sintaxe-13 atua como um marcador endosomal de reciclagem potencial para estudar a dinâmica em condições de estado constantes.
