Este protocolo ajuda a isolar os endossários de reciclagem contendo fração de células de mamíferos transfectadas para facilitar a investigação do tráfico de proteínas por meio do tráfico endocítico. Esta técnica é fácil de manusear e aplicável a amostras de tecido e células. Demonstrando o procedimento estará a Srta. Zhai Yu Qi, uma estudante de doutorado do Laboratório do Dr. Lao.
Para começar, prato 2 vezes 10 para as 6 células em um prato de cultura de 100 milímetros. No dia seguinte, transfem as células com Lipofectamina de acordo com as instruções do fabricante. Para colher as células, descarte o meio de cultura 48 horas após a transfecção e lave as células duas vezes com PBS gelado.
Em seguida, adicione um mililitro de PBS gelado suplementado com coquetel inibidor de protease 0,5X em coquetel inibidor de fosfatase 0,5X a cada prato. Em seguida, usando um raspador de células, colete as células e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. as células por centrifugação usando um rotor de balde de balanço.
Descarte o supernatante e resuspenque a pelota da célula suavemente em cinco mililitros de tampão de homogeneização. Colete as células novamente por centrifugação e resuspense a pelota celular em um mililitro de buffer de homogeneização. Homogeneize as células com um Homogeneizador Dounce usando 15 a 20 derrames.
Em seguida, transfira o homogonato para um tubo de centrifugação de dois mililitros. Adicione 700 microliters de tampão de homogeneização ao homogonato. Em seguida, gire o homogonato diluído e colete 1,5 mililitros do supernatante.
Gire o supernante coletado novamente, depois colete 1,4 mililitros do supernatante e rotule-o como supernante pós-nuclear. Para preparar a coluna de gradiente de densidade, transfira 1,2 mililitros do supernante pós-nuclear para um tubo ultracentrífuga. Em seguida, adicione um mililitro de solução de 62% de sacarose à amostra e misture bem por pipetação suave.
Em seguida, adicione cuidadosamente 3,3 mililitros de solução de 35% de sacarose em cima da amostra, seguido por 2,2 mililitros de solução de 25% de sacarose em cima da solução de 35%. Por fim, encha o tubo de ultracentrifutura até a parte superior com tampão de homogeneização. Centrifugar a coluna gradiente de densidade e coletar cuidadosamente 12 frações de 1 mililitro cada, a partir do topo do gradiente.
Em seguida, diluir todas as frações com um mililitro de tampão de diluição e centrifugar as amostras diluídas. Após a centrifugação, aspire o supernascer e adicione 50 microliters de tampão de amostra 1X para colher as frações. O marcador de reciclagem endosome Rab11 foi detectado na Fração sete.
Outros marcadores subcelulares, incluindo beta COP, COX IV, GAPDH, EEE1, Rab 7 e Lamp1 também foram sondados. Um sinal EEE1 positivo também foi detectado na Fração sete. As intensidades de banda medidas de GAPDH, Cox IV e Rab11 na Fração sete e no supernante pós-nuclear são mostradas aqui.
Após a transecção de células HEC293 com elmo1, ELMO1 ARF6Q67L ou ELMO1 ARF6Q67L FE65, não foram encontradas alterações na distribuição elmo1 com superexpressão ARF6Q67L e FE65. O nível ELMO1 na Fração sete foi comparado entre diferentes transfecções e encontrado elevado após a cotransfecção de ARF6Q67L. Observou-se um aumento adicional quando tanto a ARF6Q67L quanto a FE65 foram co-expressas.
Por outro lado, derrubar o FE65 diminuiu o enriquecimento de Elmo1 mediado arf6 na Fração sete. A fração obtida poderia ser utilizada para análise posterior. Por exemplo, a mancha ocidental para visualizar mudanças no nível da proteína na fração.
