이들 기술의 전반적인 목표는 스트렙토조토신-유도된 당뇨병성 망막병증 래트 모델에서 망막 병태생리학을 평가하는 것이다. 당뇨병성 망막병증은 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 당뇨병성 망막병증을 치료하기 위해 더 나은 효능과 더 긴 작용을 가진 약리학적 제제를 발견하기 위해 지속적인 검색이 진행되고 있다.
전임상 동물 모델에서 약리학 적 제제를 발견하는 과정은 중요한 역할을합니다. 이 동물 모델은 눈의 후부 세그먼트 조직의 구조적 및 기능적 변화를 이해하는 데 도움이됩니다. 따라서 우리는 사후 세그먼트 문제에서 이러한 변화를 연구하기 위해 세 가지 기술을 시연 할 것입니다.
우리는 층에서 망막 세포의 형태 학적 변화를 연구하기위한 조직학, 혈장에서 유리체에서 누출 된 단백질을 정량화하여 손상된 BRB를 연구하는 BRB 분해 분석, FITC-덱스트란 염료를 사용하여 망막 혈관 구조를 시각화하는 형광 혈관 조영술을 시연하고 있습니다. 고용량의 펜토바르비탈을 사용하여 쥐를 안락사시키고 검출 가능한 심장 박동없이 죽음을 확인하십시오. 눈의 비강 및 측두엽 부위에 메스 블레이드를 사용하여 절개를하여 눈을 에핵화하십시오.
그런 다음 가장자리를 따라 잘라 궤도 소켓에서 눈을 제거하십시오. 눈 주위의 과도한 지방을 제거하고 5 mL의 고정 용액에 넣으십시오. 24 내지 48 시간 동안 고정 용액에서 눈을 인큐베이션한다.
고정 후, 고정 용액으로부터 눈을 제거하고 PBS 10 mL로 채워진 페트리 디쉬로 옮긴다. 마이크로 포셉을 사용하여 시신경으로 눈을 잡고 마이크로 가위의 도움으로 파 플라나에서 닉을 만드십시오. 각막의 전체 여백을 잘라 눈의 앞쪽 컵과 뒷쪽 컵을 분리하십시오.
렌즈를 제거하고 시신경을 자릅니다. 후부 컵을 두 개의 반으로 자르고 시신경을 통과시킵니다. 각 절반을 별도의 카세트로 옮깁니다.
에탄올의 농도를 50%에서 100%에탄올로 점진적으로 증가시켜 조직을 탈수시킨다. 그리고 마지막으로, 자일렌으로 에탄올을 맑게하십시오. 조직을 섭씨 60도에서 예열 된 파라핀으로 함침시켜 조직의 자일렌을 대체하십시오.
강철 몰드를 사용하여 티슈와 카세트를 베이스로 고정하는 파라핀 블록을 준비하십시오. 블록을 준비하는 동안, 눈의 광학 디스크 부분은 강철 몰드의 바닥을 향해야합니다. 카세트를 파라핀으로 채우고 시원한 표면으로 옮깁니다.
블레이드와 카세트를 마이크로톰의 각 홀더에 장착하십시오. 마이크로톰을 사용하여 과량의 파라핀 왁스를 트리밍하고 두께 5 마이크로미터의 5 내지 여섯 개의 절편의 리본을 절단한다. 리본을 미리 데운 수조의 표면으로 옮겨 리본을 펼치십시오.
알부민으로 코팅 된 유리 슬라이드에서 섹션을 수집하십시오. 슬라이드를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 말리십시오. 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행하기 위해, 슬라이드를 섭씨 60도에서 1시간 동안 예열하여 파라핀을 녹인다.
원고에 주어진 염색 절차를 따르십시오. 조직의 재수화로 시작한 다음 Hematoxylin으로 염색 한 다음 Eosin으로 염색하십시오. 이제 조직을 탈수시키고 절편에 장착 매체를 추가하십시오.
커버 슬립을 부분에 놓고 광학 현미경으로 시각화하십시오. 혈액-망막 장벽 파괴 분석을 수행하기 위해, 케타민과 자일라진을 사용하여 쥐를 마취시키고 발가락 핀치로 마취 상태를 확인한다. 심장을 찾아 24게이지 바늘이 있는 1mL 주사기를 삽입하여 심장 천자로 혈액을 채취합니다.
충분한 혈액이 수집되면 EDTA 코팅 튜브로 옮깁니다. 용혈을 방지하기 위해 부드럽게 섞으십시오. 눈을 핵을 제거하고 즉시 드라이 아이스로 옮깁니다.
얼어 붙은 조건에서 각막과 렌즈를 제거하여 눈의 해부를 시작하십시오. 망막의 오염없이 포셉을 사용하여 눈의 후부 부분에서 유리체를 당깁니다. 그것을 세 개에서 네 개의 비드로 균질화 튜브로 옮깁니다.
비드 호모게나이저를 사용하여 샘플을 중간 속도로 10초 동안 균질화한다. 혈액과 유리체 유머 샘플을 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 더 많이 처리하십시오. 두 시료 모두를 섭씨 4도에서 10분 동안 5, 200 g에서 원심분리한다.
다중 채널 피펫을 사용하여 250 마이크로 리터의 브래드 포드 시약을 우물에 넣으십시오. PBS를 사용하여 유리체 샘플을 10배 희석하고 혈장 샘플을 20배 희석한다. 희석 된 샘플 5 마이크로 리터를 브래드 포드 시약에 넣고 잘 섞으십시오.
샘플을 20 내지 30분 동안 인큐베이션한 다음, 96-웰 플레이트 판독기를 사용하여 590 나노미터에서 흡광도를 측정하였다. 샘플의 강도는 단백질의 농도에 직접적으로 비례합니다. 형광 혈관조영술을 수행하기 위해, 3%isoflurane을 사용하여 쥐를 마취시키고 발가락 펀치로 마취 상태를 확인하였다.
염료를 주입하기 전에 꼬리를 따뜻한 물에 담그십시오. FITC-덱스트란 용액 mL당 50mg의 1mL를 측방 꼬리 정맥에 주입한다. 염료가 5 ~ 10 분 동안 순환하도록하십시오.
펜토바르비탈을 사용하여 쥐를 안락사시키고 검출 가능한 심장 박동으로 죽음을 확인하십시오. 눈을 핵으로 만들고 평평한 마운트 준비를 진행하십시오. 망막 플랫 마운트를 준비하려면 섬유질이없는 킴 와이프에 눈을 놓고 눈의 앞쪽 부분을 자릅니다.
눈의 후부 부분에서 유리체 유머와 함께 렌즈를 천천히 당깁니다. 후부 세그먼트를 PBS로 채워진 페트리 접시로 옮기고 시신경을 자릅니다. 이제 공막과 망막 사이에 뾰족한 집게의 끝을 놓습니다.
컵의 테두리를 따라 부드럽게 움직여 망막이 어느 시점에서도 공막에 부착되지 않도록하십시오. 망막이 공막에서 완전히 분리되도록 광학 디스크 근처를 자릅니다. 망막이 어느 쪽의 공막에도 부착되지 않은 것이 확인되면 PBS 용액으로 천천히 밀어 넣으십시오.
포셉의 도움으로 망막을 손상시키지 않고 깨끗한 유리 슬라이드로 옮깁니다. 마이크로 가위 또는 메스 블레이드를 사용하여 그림과 같이 망막을 네 번 잘라 네 개의 사분면으로 나눕니다. 망막 주변에서 과도한 PBS를 제거하고 망막 플랫 마운트에 변색 방지 장착 매체를 추가하십시오.
커버 슬립으로 덮고 공초점 현미경으로 플랫 마운트를 시각화하십시오. 형광 혈관 조영술의 전체 과정은 FITC-덱스트란 염료로부터의 형광의 담금질을 피하기 위해 최소 광 하에서 수행된다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 당뇨병 쥐에서 망막 세포는 변성을 겪으며 이로 인해 합병증이 발생합니다.
이러한 구조적 변화는 망막의 세포 수와 두께를 결정하기 위해 조직학 기술에 의해 시각화 될 수 있습니다. 당뇨병 쥐의 경우, 부종으로 인해 망막층의 두께가 증가합니다. 따라서이 기술은 당뇨병 성 망막 병증을 치료하기 위해 다양한 잠재적 인 약리학 적 제제를 스크리닝하는 데 도움이됩니다.
당뇨병으로 인한 망막의 대사 변화는 혈관주위세포의 손실과 혈액-망막 장벽의 붕괴를 야기한다. 망막과 유리체로 단백질 및 기타 생체 분자가 누출됨에 따라 당뇨병 쥐의 유리체에서 총 단백질 수준이 증가합니다. 혈액 망막 장벽의 붕괴를 예방하면 당뇨병 성 망막 병증의 진행을 크게 방해 할 수 있습니다.
당뇨병성 망막증에서, 혈관 내피 성장 인자의 발현은 새로운 혈관의 형성으로 이어지는 증가한다. 이 혈관은 정상적인 망막 구조를 방해하므로 당뇨병 성 망막 병증을 치료하는 데 주된 관심사입니다. 형광 혈관 조영술 기술은 여기에서 강조 표시된 바와 같이 새로운 혈관과 혈관의 누출을 시각화하는 데 사용됩니다.
그러나 혈관신생은 당뇨병 유발 후 6 ~ 12 개월 후에 만 두드러집니다. 이 기술은 혈관 신생 및 혈관 누출의 신경 과민에 대한 약물 치료의 효과를 정량화하는 데 도움이됩니다. 당뇨병성 망막병증의 미래 치료는 보다 효율적인 약리학적 제제를 필요로 하지만, 미래의 치료는 질병 병인에 대한 더 나은 이해를 통해서만 달성될 수 있다.
이러한 기술을 습득하면 연구자가 당뇨병 성 망막 병증의 병인에 대해 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 더 나은 약리학 적 개입의 발견으로 이어질 수 있습니다.
