L’objectif global de ces techniques est d’évaluer la physiopathologie rétinienne dans le modèle de rat de rétinopathie diabétique induite par la streptozotocine. La rétinopathie diabétique est l’une des principales causes de cécité. La recherche continue est en cours pour découvrir des agents pharmacologiques avec une meilleure efficacité et une action plus longue pour traiter la rétinopathie diabétique.
Le processus de découverte d’agents pharmacologiques dans des modèles animaux précliniques joue un rôle essentiel. Ces modèles animaux aident à comprendre les altérations structurelles et fonctionnelles des tissus du segment postérieur de l’œil. Par conséquent, nous allons démontrer trois techniques différentes pour étudier ces altérations dans les problèmes du segment postérieur.
Nous démontrons l’histologie pour étudier les changements morphologiques des cellules rétiniennes dans les couches, le test de dégradation BRB pour étudier la BRB compromise en quantifiant les protéines fuyantes dans le vitré à partir du plasma, et aussi l’angiographie fluoresce pour visualiser le système vasculaire rétinien à l’aide du colorant FITC-dextran. Euthanasier le rat en utilisant une forte dose de pentobarbital et confirmer sa mort sans rythme cardiaque détectable. Énucléez l’œil en faisant des incisions à l’aide d’une lame de scalpel sur les régions nasale et temporale de l’œil.
Ensuite, coupez le long de ses bords pour retirer l’œil de l’orbite orbitale. Retirez l’excès de graisse entourant l’œil et placez-le dans 5 mL de solution fixatrice. Incuber l’œil dans une solution fixative pendant 24 à 48 heures.
Après la fixation, retirer l’œil de la solution fixatrice et transférer dans une boîte de Petri remplie de 10 mL de PBS. À l’aide de micro-pinces, tenez l’œil avec le nerf optique et faites une entaille au pars plana à l’aide de micro-ciseaux. Coupez toute la marge de la cornée pour séparer la coupe antérieure et la coupe de l’œil postérieure.
Retirez la lentille et coupez le nerf optique. Coupez la coupe postérieure en deux moitiés, en passant par le nerf optique. Transférez chaque moitié dans les cassettes séparées.
Déshydratez les tissus en augmentant progressivement la concentration d’éthanol de 50% à 100% d’éthanol. Et enfin, nettoyez l’éthanol avec du xylène. Imprégner le tissu avec de la paraffine préchauffée à 60 degrés Celsius pour remplacer le xylène dans le tissu.
Préparez les blocs de paraffine à l’aide d’un moule en acier pour maintenir le tissu et la cassette comme base. Lors de la préparation du bloc, la partie du disque optique de l’œil doit faire face au fond du moule en acier. Remplissez la cassette de paraffine et transférez-la sur une surface fraîche.
Montez la lame et la cassette sur les supports respectifs sur microtome. À l’aide d’un microtome, coupez l’excès de cire de paraffine et coupez un ruban de cinq à six sections d’une épaisseur de 5 micromètres. Transférez le ruban sur la surface du bain-marie préchauffé pour déplier le ruban.
Recueillir les sections sur une lame de verre recouverte d’albumine. Laissez les lames sécher pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Pour effectuer la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, préchauffez les lames à 60 degrés Celsius pendant 1 heure pour faire fondre la paraffine.
Suivez la procédure de coloration indiquée dans le manuscrit. Commencez par la réhydratation des tissus, puis colorez avec de l’hématoxyline suivie d’éosine. Maintenant, déshydratez le tissu et ajoutez un milieu de montage sur les sections.
Placez le couvercle sur des sections et visualisez au microscope optique. Pour effectuer un test de dégradation de la barrière hémato-rétinienne, anesthésiez le rat à l’aide de kétamine et de xylazine et confirmez l’état anesthésique par pincement des orteils. Localisez le cœur et insérez une seringue de 1 mL avec une aiguille de calibre 24 pour prélever le sang par ponction cardiaque.
Une fois que le sang suffisant est recueilli, transférez-le dans un tube enduit d’EDTA. Mélangez-le doucement pour éviter l’hémolyse. Énucléez l’œil et transférez-le immédiatement à la glace sèche.
Dans des conditions de congélation, commencez la dissection de l’œil par l’ablation de la cornée et du cristallin. Tirez le vitré du segment postérieur de l’œil à l’aide d’une pince sans aucune contamination de la rétine. Transférez-le dans un tube d’homogénéisation avec trois à quatre perles.
Homogénéiser les échantillons à l’aide d’un homogénéisateur de billes à vitesse moyenne pendant 10 secondes. Transférer des échantillons de sang et d’humeur vitrée dans des tubes de microcentrifugation pour les traiter davantage. Centrifuger les deux échantillons à 5 200 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius.
À l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez 250 microlitres de réactif Bradford dans les puits. Diluer les échantillons vitrés 10 fois et les échantillons plasmatiques 20 fois à l’aide de PBS. Ajouter 5 microlitres d’échantillons dilués au réactif Bradford et bien mélanger.
Incuber les échantillons pendant 20 à 30 minutes, puis mesurer l’absorbance à 590 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques à 96 puits. L’intensité de l’échantillon est directement proportionnelle à la concentration en protéines. Pour effectuer une angiographie par fluorescence, anesthésiez le rat à l’aide de 3% d’isoflurane et confirmez l’état anesthésique par coup de poing.
Trempez la queue dans de l’eau tiède avant d’injecter le colorant. Injecter 1 mL de 50 mg par mL de solution de FITC-dextran dans la veine latérale de la queue. Laissez le colorant circuler pendant 5 à 10 minutes.
Euthanasier le rat à l’aide de pentobarbital et confirmer sa mort par aucun battement de cœur détectable. Énucléez l’œil et procédez à la préparation du montage à plat. Pour préparer le montage plat rétinien, placez l’œil sur un Kimwipe sans fibres et coupez la partie antérieure de l’œil.
Tirez lentement la lentille, avec l’humeur vitrée, du segment postérieur de l’œil. Transférer le segment postérieur dans une boîte de Petri remplie de PBS et couper le nerf optique. Maintenant, placez la pointe de la pince pointue entre la sclérotique et la rétine.
Déplacez-le doucement tout le long du bord de la coupe pour vous assurer que la rétine n’est attachée à la sclérotique à aucun moment. Couper près du disque optique, de sorte que la rétine se détache complètement de la sclérotique. Une fois qu’il est confirmé que la rétine n’est attachée à la sclérotique d’aucun côté, poussez-la lentement dans la solution pbsienne.
À l’aide d’une pince, transférez la rétine sur une lame de verre propre sans lui causer de dommages. À l’aide d’un micro-ciseau ou d’une lame de scalpel, faites quatre coupes sur la rétine, comme indiqué, pour la diviser en quatre quadrants. Retirez l’excès de PBS de l’environnement rétinien et ajoutez un support de montage anti-décoloration sur le support plat rétinien.
Couvrez-le avec un couvercle et visualisez la monture plate au microscope confocal. Il est important de noter ici que l’ensemble du processus d’angiographie par fluorescence est effectué sous un minimum de lumière pour éviter la trempe de la fluorescence du colorant FITC-dextran. Chez le rat diabétique, les cellules rétiniennes subissent une dégénérescence, ce qui entraîne d’autres complications.
Ces altérations structurelles peuvent être visualisées par une technique d’histologie pour déterminer le nombre de cellules et l’épaisseur de la rétine. Dans le cas des rats diabétiques, l’épaisseur des couches rétiniennes augmente en raison de l’œdème. Par conséquent, cette technique aide à dépister divers agents pharmacologiques potentiels pour traiter la rétinopathie diabétique.
Les changements métaboliques dans la rétine dus au diabète provoquent la perte de péricytes et la rupture de la barrière hémato-rétinienne. Comme il y a fuite de protéines et d’autres biomolécules dans la rétine et le vitré, les niveaux de protéines totales augmentent dans le vitré des rats diabétiques. La prévention de la dégradation de la barrière hémato-rétinienne pourrait entraver considérablement la progression de la rétinopathie diabétique.
Dans la rétinopathie diabétique, l’expression du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire augmente, ce qui conduit à la formation de nouveaux vaisseaux. Ces vaisseaux perturbent la structure rétinienne normale et, par conséquent, son innervation est une préoccupation majeure pour traiter la rétinopathie diabétique. La technique d’angiographie par fluorescence est utilisée pour visualiser de nouveaux vaisseaux sanguins et des fuites de vaisseaux sanguins, comme souligné ici.
Cependant, l’angiogenèse n’est importante qu’après six à 12 mois d’induction du diabète. Cette technique nous aide à quantifier l’effet du traitement médicamenteux sur l’innervation de l’angiogenèse et les fuites vasculaires. Le traitement futur de la rétinopathie diabétique nécessite des agents pharmacologiques plus efficaces, mais les futurs traitements ne peuvent être réalisés que par une meilleure compréhension de la pathogenèse de la maladie.
La maîtrise de ces techniques pourrait aider les chercheurs à mieux comprendre la pathogenèse de la rétinopathie diabétique, ce qui pourrait conduire à la découverte de meilleures interventions pharmacologiques.
