Общей целью этих методов является оценка патофизиологии сетчатки в модели крыс, вызванной стрептозотоцином. Диабетическая ретинопатия является одной из ведущих причин слепоты. Непрерывный поиск продолжается, чтобы обнаружить фармакологические агенты с лучшей эффективностью и более длительным действием для лечения диабетической ретинопатии.
Процесс обнаружения фармакологических агентов на доклинических моделях животных играет жизненно важную роль. Эти животные модели помогают понять структурные и функциональные изменения тканей заднего сегмента глаза. Поэтому мы продемонстрируем три различных метода изучения этих изменений в вопросах заднего сегмента.
Мы демонстрируем гистологию для изучения морфологических изменений клеток сетчатки в слоях, анализ распада BRB для изучения скомпрометированного BRB путем количественной оценки просочившегося белка в стекловидном теле из плазмы, а также флуоресцентную ангиографию для визуализации сосудистой системы сетчатки с использованием красителя FITC-декстран. Усыпляют крысу, используя высокие дозы пентобарбитала и подтверждают ее смерть без обнаруживаемого сердцебиения. Энуклеат глаза, делая разрезы с помощью лезвия скальпеля на носовой и височной областях глаза.
Затем обрежьте по его краям, чтобы удалить глазок из орбитальной впадины. Удалите лишний жир, окружающий глаз, и поместите его в 5 мл фиксирующего раствора. Инкубируют глаз в фиксаторном растворе в течение 24-48 часов.
После фиксации удаляют глаз из фиксирующего раствора и перекладывают на чашку Петри, наполненную 10 мл PBS. Используя микрощипцы, удерживайте глаз зрительным нервом и сделайте кольцу на pars plana с помощью микроножек. Прорежьте весь край роговицы, чтобы отделить переднюю чашечку и заднюю чашку глаза.
Снимите хрусталик и перережьте зрительный нерв. Разрезать заднюю чашечку на две половинки, проходя через зрительный нерв. Переложите каждую половинку в отдельные кассеты.
Обезвоживают ткани путем постепенного повышения концентрации этанола с 50% до 100% этанола. И, наконец, очистите этанол с ксилолом. Пропитать ткань предварительно нагретым парафином при 60 градусах Цельсия, чтобы заменить ксилол в ткани.
Подготовьте парафиновые блоки, используя стальную форму, чтобы удерживать ткань и кассету в качестве основы. Во время подготовки блока часть глаза, посвященная диску зрительного нерва, должна быть обращена к нижней части стальной формы. Наполните кассету парафином и переложите на холодную поверхность.
Установите лезвие и кассету на соответствующие держатели на микротоме. Используя микротом, обрежьте лишний парафиновый воск и перережьте ленту из пяти-шести секций толщиной 5 микрометров. Переложите ленту на поверхность предварительно подогретой водяной бани, чтобы развернуть ленту.
Соберите секции на стеклянной горке, покрытой альбумином. Дайте горкам высохнуть ночью при температуре 37 градусов по Цельсию. Чтобы выполнить окрашивание гематоксилином и эозином, разогрейте слайды при 60 градусах Цельсия в течение 1 часа, чтобы расплавить парафин.
Следуйте процедуре окрашивания, приведенной в рукописи. Начинают с регидратации тканей, а затем окрашивают гематоксилином с последующим Эозином. Теперь обезвоживаем ткань и добавляем монтажную среду на срезы.
Поместите крышку на секции и визуализируйте под световым микроскопом. Чтобы выполнить анализ разрушения барьера сетчатки крови, обезболить крысу с помощью кетамина и ксилазина и подтвердить анестезирующее состояние путем ущемления пальца ноги. Найдите сердце и вставьте шприц 1 мл с иглой 24-го калибра, чтобы взять кровь путем прокола сердца.
Как только будет собрано достаточное количество крови, перенесите ее в трубку, покрытую ЭДТА. Осторожно перемешайте его, чтобы предотвратить гемолиз. Энуклеазируйте глаз и сразу же перенесите его на сухой лед.
В замороженных условиях начинают рассечение глаза с удаления роговицы и хрусталика. Вытяните стекловидное тело из заднего сегмента глаза с помощью щипцов без какого-либо загрязнения от сетчатки. Переложите его в гомогенизирующую трубку с тремя-четырьмя шариками.
Гомогенизируйте образцы с помощью гомогенизатора шариков на средней скорости в течение 10 секунд. Перенесите образцы крови и стекловидного тела в микроцентрифужные трубки для дальнейшей обработки. Центрифугируйте оба образца по 5, 200 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.
Используя многоканальную пипетку, добавьте в скважины 250 микролитров реагента Брэдфорда. Разбавьте образцы стекловидного тела 10 раз и образцы плазмы 20 раз с помощью PBS. Добавьте 5 микролитров разбавленных образцов в реагент Брэдфорда и хорошо перемешайте.
Инкубируйте образцы в течение 20-30 минут, а затем измеряйте поглощение на 590 нанометрах с помощью 96-луночного пластинчатого считывателя. Интенсивность пробы прямо пропорциональна концентрации белка. Для выполнения флуоресцентной ангиографии обезболивают крысу с помощью 3% изофлурана и подтверждают анестетиковое состояние ударом пальца ноги.
Окуните хвост в теплую воду перед инъекцией красителя. Вводят 1 мл 50 мг на мл раствора FITC-декстрана в боковую хвостовую вену. Дайте красителю циркулировать в течение 5-10 минут.
Усыплите крысу с помощью пентобарбитала и подтвердите ее смерть без обнаружения сердцебиения. Энуклеарьте глаз и приступайте к подготовке плоского крепления. Чтобы подготовить плоское крепление сетчатки, поместите глаз на безволокнистый Kimwipe и срежьте переднюю часть глаза.
Медленно потяните хрусталик вместе со стекловидным телом из заднего сегмента глаза. Переместите задний сегмент в чашку Петри, заполненную PBS, и перережьте зрительный нерв. Теперь поместите кончик заостренного щипца между склерой и сетчаткой.
Осторожно переместите его по всему краю чашки, чтобы убедиться, что сетчатка не прикреплена к склере в любой точке. Разрезают возле диска зрительного нерва, так что сетчатка полностью отделяется от склеры. Как только будет подтверждено, что сетчатка не прикреплена к склере с любой стороны, медленно протолкните ее в раствор PBS.
С помощью щипца перенесите сетчатку на чистый стеклянный слайд, не нанося ей никакого ущерба. С помощью микроножек или лезвия скальпеля сделайте четыре надреза на сетчатке, как показано на рисунке, разделите ее на четыре квадранта. Удалите излишки PBS из окружения сетчатки и добавьте антиувядающую монтажную среду на плоское крепление сетчатки.
Накройте его чехлом и визуализируйте плоское крепление под конфокальным микроскопом. Здесь важно отметить, что весь процесс флуоресцентной ангиографии выполняется при минимальном освещении, чтобы избежать гашения флуоресценции от красителя FITC-декстран. У крыс с диабетом клетки сетчатки подвергаются дегенерации, что приводит к дальнейшим осложнениям.
Эти структурные изменения могут быть визуализированы с помощью гистологической техники для определения количества клеток и толщины сетчатки. У крыс с диабетом толщина слоев сетчатки увеличивается из-за отеков. Следовательно, этот метод помогает скрининг различных потенциальных фармакологических агентов для лечения диабетической ретинопатии.
Метаболические изменения сетчатки из-за диабета вызывают потерю перицитов и разрушение гемато-ретинального барьера. Поскольку происходит утечка белка и других биомолекул в сетчатку и стекловидное тело, уровни общего белка увеличиваются в стекловидном теле диабетических крыс. Предотвращение разрушения гемато-ретинального барьера может значительно затруднить прогресс диабетической ретинопатии.
При диабетической ретинопатии повышается экспрессия фактора роста эндотелия сосудов, что приводит к образованию новых сосудов. Эти сосуды нарушают нормальную структуру сетчатки, и поэтому ее иннервация имеет первостепенное значение для лечения диабетической ретинопатии. Метод флуоресцентной ангиографии используется для визуализации новых кровеносных сосудов, а также утечки кровеносных сосудов, как подчеркивается здесь.
Тем не менее, ангиогенез заметен только после шести-12 месяцев индукции диабета. Этот метод помогает нам количественно оценить влияние медикаментозного лечения на иннервацию ангиогенеза и сосудистую утечку. Будущее лечение диабетической ретинопатии нуждается в более эффективных фармакологических средствах, но будущие методы лечения могут быть достигнуты только путем лучшего понимания патогенеза заболевания.
Освоение этих методов может помочь исследователям лучше понять патогенез диабетической ретинопатии, что может привести к открытию лучших фармакологических вмешательств.
