Esse protocolo é significativo porque desenvolvemos um modelo clinicamente relevante de lesão cerebral induzida por IVH e hidrocefalia, utilizando injeção de hemoglobina nos ventrículos, o que permite a posterior quantificação dos volumes ventrículos na aplicação, para testar novas estratégias terapêuticas. A principal vantagem desta técnica é que ela permite o estudo da patologia da IVH que é especificamente mediada por hemoglobina e produtos de degradação do sangue da via de ferro. Esta técnica também é fácil de usar e versátil.
As implicações dessa técnica se estendem para o desenvolvimento de terapias para hidrocefalia pós-hemorrágica, pois permite uma maior compreensão da fisiopatologia da IVH e a valorização de estratégias de tratamento clinicamente relevantes para a prevenção de sequelas neurológicas após IVH. Demonstrando o procedimento estará Sruthi Ramagiri, um Pós-Doutor Associado do Laboratório da Austrália. Para iniciar coloque o rato anestesiado propenso no aparelho estereotáxico com o nariz posicionado no adaptador anestésico.
Em seguida, prenda a cabeça apertando as barras auriculares não rupturas no conduto auditivo externo. Para limpar a cabeça, primeiro toque em um aplicador de ponta de algodão estéril embebido em Betadine no centro da cabeça e mova-se para fora para espalhar o Betadine em círculos. Em seguida, repita o processo com um aplicador embebido em etanol a 70%.
Em seguida, usando um bisturi, faça uma incisão de 0,3 centímetro verticalmente no centro da cabeça para expor o bregma do crânio. Em seguida, seque a área usando um aplicador com ponta de algodão. Para configurar o injetor estereotáxico, desenhe a solução de hemoglobina previamente preparada em uma seringa de 0,3 ou 0,5 mililitro e coloque a seringa no sistema injetor estereotáxico.
Em seguida, ative a interface do injetor estereotáxico e clique no botão de configuração para inserir o volume de injeção e as configurações de taxa. Clique no volume e defina o volume em 20.000 nanolitros. Em seguida, clique em taxa de infusão e defina a taxa em 8.000 nanolitros por minuto.
Clique no botão de redefinição de posição para sair da configuração. Lave a ponta da agulha clicando no botão de infusão até que uma pequena gota de hemoglobina apareça na ponta da agulha e, em seguida, use um aplicador com ponta de algodão para remover suavemente o talão. Para iniciar a injeção animal, defina o bregma como zero no sistema de injeção estereotáxica, ajustando as posições mediolateral e anteroposterior da seringa.
Em seguida, abaixe a agulha da seringa para tocar o crânio no bregma suavemente. Depois de identificar as coordenadas de escolha, levante a agulha da seringa um centímetro acima do crânio para limpar o couro cabeludo. Defina as coordenadas mediolaterais e anteroposteriores.
Em seguida, abaixe a seringa para que a agulha toque suavemente o crânio e defina a coordenada dorsoventral ao longo de 30 segundos. Uma vez que as coordenadas tenham sido definidas, inicie a injeção clicando no botão Executar na interface do injetor estereotáxico. Após o término da injeção, deixe a agulha no lugar por dois minutos para minimizar o refluxo da solução.
Em seguida, retire lentamente a seringa ao longo da coordenada dorsoventral durante dois minutos, até que a ponta da agulha esteja dois centímetros acima do couro cabeludo. Em seguida, gire o braço injetor estereotáxico para longe do campo operatório e feche o couro cabeludo com uma sutura de monofilamento 6-O. Para a RNM, realize imagens ponderadas em T2 selecionando uma sequência de ecoeco de spin rápido ponderada em T2.
Depois de definir os parâmetros de ressonância magnética conforme descrito no texto, clique no botão continuar para iniciar a sequência. Para processamento de imagens e análise de volume cerebral, abra os dados ponderados T2 nativos no software de segmentação. Para delinear manualmente os ventrículos laterais, clique no modo pincel e selecione o estilo de pincel quadrado e, em seguida, ajuste o tamanho do pincel para um.
Em seguida, clique em inspetor de layout, selecione modo de exibição axial e clique em zoom para ajustar. Em seguida, coloque o cursor sobre a imagem e trace e preencha o espaço do ventrículo lateral. Finalmente, clique em segmentação na barra de ferramentas, seguido de volume e estatísticas para visualizar os volumes segmentados.
Os animais submetidos à injeção de hemoglobina desenvolveram ventriculomegalia moderada quando avaliados por RM. Com ventrículos laterais significativamente maiores em 24 horas e 72 horas após a injeção de hemoglobina, em comparação com os animais injetados com ACSF. Embora a diferença no volume ventricular lateral entre os dois grupos de ratos não tenha sido significativa após 38 dias, a ressonância magnética demonstrou que 44% dos ratos que receberam hemoglobina ainda tinham ventriculomegalia não resolvida.
Além disso, em comparação com a ACSF, a injeção de hemoglobina resultou em uma diminuição significativa no volume da substância branca após 38 dias. A hemoglobina também promoveu uma resposta inflamatória in vivo, como evidenciado pelo nível significativamente mais alto do fator de necrose tumoral de citocinas pró-inflamatórias alfa após a injeção de hemoglobina, mas não de solução salina ou sangue total. Além disso, a coloração imuno-histoquímica da proteína glial fibrilar ácida revelou uma ativação significativamente maior de astrócitos após a injeção de hemoglobina do que após a injeção de ACSF.
A coisa mais importante a lembrar ao tentar este procedimento é definir as coordenadas de injeção corretas para garantir a entrega de hemoglobina nos ventrículos laterais. Após esse procedimento, os traçadores do LCR podem ser entregues no espaço do LCR para avaliar as mudanças na circulação do LCR e os padrões de efluxo após a IVH. Este método adicional aborda como o fluxo do LCR é alterado na HPH IVH.
