Nós fornecemos um protocolo para estabelecer hemorragia pontina maciça em um rato. Este modelo é fácil de estabelecer, repetível e altamente bem sucedido. Injeção destilada de método de rato autólogo poderia ser usada para causar hemorragia em qualquer uma das regiões cerebrais.
As pessoas que querem experimentar essas técnicas devem aprender a usar um quadro estereotaxic, e estar familiarizados com a anatomia pontina. Comece colocando uma cortina cirúrgica sobre o mouse. Faça uma incisão com um bisturi ao longo da linha média marcada.
Use um cotonete para remover qualquer sangue em potencial. Em seguida, coloque um pedaço de fórceps em cada lado da aba do couro cabeludo para expor o crânio. Mergulhe um cotonete em 0,9% salino e remova suavemente os tecidos conjuntivos do osso do crânio.
Use uma caneta marcadora para marcar o ponto central do bregma como o ponto de origem. Faça uma craniotomia usando uma micro broca, procedendo cuidadosamente. Quando terminar, remova a micro broca do quadro estereotaxic.
Coloque uma seringa Hamilton de 100 microliter no suporte estereotipado. Ligue o interruptor da bomba de injeção. Clique no botão de inalação rápida.
Em seguida, aspirar a solução de heparina para 100 microliters e drená-la completamente. Aplique clorexidina e 75% de álcool esfoliante cirúrgico em todo o conto da raiz à ponta pelo menos três vezes para desinfetar a pele, suavizar o chifre e dilatar a veia da cauda para aumentar a taxa de sucesso da injeção. Conecte uma acupuntura do couro cabeludo a uma seringa de um mililitro, em seguida, insira a acupuntura do couro cabeludo em uma veia lateral da cauda três centímetros da ponta da cauda e tome 150 microliters de sangue.
Remova a acupuntura do couro cabeludo da seringa de um mililitro e transfira o sangue para um tubo. Trabalhando rapidamente para evitar a coagulação do sangue. Troque as luvas cirúrgicas.
Selecione o modo de retirada. Defina o volume para 100 microliters e ajuste a velocidade para 200 microliters por minuto. Clique no botão executar e aspire 100 microliters de sangue na seringa Hamilton.
Mude para o modo de infusão e ajuste a velocidade para um microliter por minuto. Avance a seringa até que a ponta atinja 9,2 milímetros abaixo da superfície do cérebro e injete os primeiros 10 microliters de sangue. Clique no botão executar.
Pare a injeção e deixe a seringa em posição por 20 minutos para evitar que o sangue flua para o espaço subaracnóide. Retraia a seringa até que a ponta chegue a nove milímetros abaixo da superfície do cérebro, em seguida, reinicie a injeção na mesma velocidade de um microliter por minuto até que o sangue residual tenha sido injetado completamente. Deixe a seringa em posição por 10 minutos para evitar o fluxo sanguíneo.
Remova a seringa do cérebro lentamente. Em seguida, use cimento ósseo para cobrir o buraco da craniotomia. Quando o cimento seca a ferida com um filamento de sutura de poliamida de quatro zero.
Depois de costurar três ou quatro pontos, amarre 2 nós cirúrgicos padrão de um a um. Observe o rato a cada 15 minutos até que ele se recupere totalmente da anestesia, em seguida, devolva-o para a gaiola original com uma almofada de aquecimento por baixo. Forneça ao rato acesso gratuito a comida e água.
Foram utilizados 25 animais para controle de 30 microliter, 60 microliter e 100 injeções de sangue de microliter. Os testes comportamentais foram realizados nos dias um, três, sete e 14 após a cirurgia. A hemorragia pontina causou déficits neurológicos como reflexo córnea diminuído e circulação.
A injeção de 100 microliters de sangue também induziu a miotonia. A ressonância magnética foi realizada 24 horas após a cirurgia. Nos grupos de injeção de sangue, a hemorragia foi detectada como uma borda de hipointense com iso para núcleo ligeiramente hiperintense na parte basiler das lagoas.
O volume de hemorragia aumentou com o volume de injeção. Os ratos foram sacrificados às 24 horas e 14 dias após a cirurgia. E duas seções de espessura foram feitas.
Hemorragia foi detectada ao redor do local da injeção e distribuída na base das lagoas. Houve um pequeno edema em torno da hemorragia no grupo de injeção de sangue de 100 microliter. Alguns dos ratos foram sacrificados três dias após a cirurgia e seções de parafina foram feitas para coloração he.
Os resultados mostraram que nos grupos de injeção de sangue as células inflamatórias enriquecidas na zona de hemorragia para a hemoglobina permaneceram contidas com glóbulos vermelhos intactos. Ao tentar este protocolo certifique-se de lembrar a posição de injeção. Este método pode ser usado para induzir uma hemorragia em qualquer região cerebral específica.
