A interpretação dos dados de sequenciamento gerados pelo experimento de criação de perfil ribossosome é fundamental para medir quantitativamente as atividades translacionais dos ribossomos no mRNA e para estudar os mecanismos de regulação translacional. Neste protocolo, descreveremos o procedimento computacional para a utilização dos dados de perfil ribossomo e do RiboCode, uma ferramenta de linha de comando para decodificar a tradução de mRNA em escala de genoma e resolução de nucleotídeos únicos. Este método permite procurar os novos peptídeos decorrentes das regiões genômicas fora dos genes de codificação de proteínas anotadas, e oferece uma oportunidade de quantificar a taxa de tradução de mRNA.
Para começar, abra uma janela de terminal Linux e crie um ambiente conda executando o comando. Mude para o ambiente criado e instale o RiboCode e as dependências executando o comando. Para obter os arquivos de referência do genoma para a sequência de referência, vá para o site da Ensembl, em seguida clique em download, seguido de download ftp.
Clique na opção FASTA na coluna DNA FASTA e selecione a linha onde as espécies são humanas, mostrada na tabela na página do site. Na página do site da Ensembl, copie o link como mencionado no texto, depois baixe e descompacte os arquivos no terminal executando o comando. Para anotação de referência, clique com o botão direito do mouse em GTF nos conjuntos genéticos da coluna na última página aberta da Web.
Copie o link e baixe-o usando o comando. Para obter sequências de rRNA, abra o navegador de genoma do UCSC e clique em ferramentas e selecione o navegador de tabela na lista suspensa. Na página do navegador do genoma da UCSC, especifique mamífero para clade, humano para genoma, todas as tabelas para grupo, máscara R para mesa e genoma para região.
Para filtrar, clique em criar para ir a uma nova página e definir a classe de representante, assim como o rRNA de correspondência. Clique em enviar e, em seguida, defina o formato de saída como sequência e nome do arquivo de saída como HG38_rRNA. FA. Finalmente, clique em obter saída e selecione obter sequência para recuperar a sequência de rRNA.
Para obter conjuntos de dados de perfil ribossomo do arquivo de leitura de sequência, baixe as amostras de réplica do grupo de tratamento si-eIFe e renomeie-os executando o comando. Em seguida, baixe as amostras de réplica do grupo de controle e renomeie-as executando o comando. Para remover a contaminação do rRNA, comece a indexar sequências de referência de rRNA executando o comando.
Após a indexação, alinhe as leituras à referência rRNA para excluir as leituras originárias do rRNA executando o comando. Comece criando um índice de genoma executando o comando. Em seguida, alinhe as leituras limpas sem contaminação de rRNA à referência criada executando o comando e, em seguida, classificar e indexar arquivos executando o comando.
Prepare as anotações da transcrição executando o comando. Selecione fragmentos protegidos por ribossomo de comprimentos específicos e identifique suas posições no local P executando o comando. Edite os arquivos de configuração para cada amostra e mescle-os.
Em seguida, execute o RiboCode executando o comando. A distribuição de frequência dos comprimentos das leituras mostrou que a maioria dos fragmentos protegidos por ribossomo correspondem a 25 a 35 nucleotídeos. Os locais P-local para diferentes comprimentos de fragmentos protegidos por ribossomo foram determinados examinando as distâncias de suas cinco extremidades primos para o início anotado e parar códons.
Os resultados do mapeamento mostram que 10.394 genes codificam para quadros de leitura aberto anotados. Além disso, 509 e 168 genes codificam quadros de leitura abertos a montante e a jusante, enquanto 939 genes codificam para quadros de leitura abertos a montante ou a jusante, sobrepostos com quadros de leitura abertos anotados conhecidos. Além disso, 68 genes de codificação de proteínas e 2.601 genes não codificados codificam para novos quadros de leitura aberta.
A distribuição de comprimento mostrou que os quadros de leitura abertos a montante, rio abaixo, novos e sobrepostos eram mais curtos do que os quadros de leitura abertos anotados. As contagens relativas de fragmentos protegidos por ribossomo foram calculadas para cada quadro de leitura aberto, revelando que as densidades ribossósas de quadros de leitura abertas a montante foram significativamente maiores em células deficientes eIF3e do que em células de controle. A análise metagene revelou que uma massa de ribossomos parou entre os códons 25 e 75 a jusante do codon inicial, sugerindo que o alongamento da tradução poderia ser bloqueado no início das células deficientes do eIF3e.
Os perfis de densidade dos locais P para quadros de leitura abertos a montante de PSMA6 e quadros de leitura abertos a jusante do gene SENP3-EIF4A1 foram examinados, demonstrando os padrões de periodicidade e densidades de fragmentos protegidos por ribossomo. Verificar os locais das leituras ao redor do início e parar códons de regiões conhecidas de codificação de proteínas é necessário para avaliar as propriedades periódicas das leituras para cada comprimento. RiboCode, juntamente com outra ferramenta de linha de comando, o RiboMiner também pode realizar controle de qualidade e múltiplas análises, como quantificar e visualizar as ocupações dos ribossomos nos quadros de leitura aberto previstos.
Esta ferramenta computacional fornece uma maneira de identificar eventos de tradução nãocanônica com dados de perfil ribossomo em contextos fisiológicos específicos e como a tradução modula em resposta ao estímulo.
