Este trabalho foi apoiado pelo Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (BMBF), a Biologia de Sistemas de Sinalização em Câncer (Helmholtz Alliance em Biologia de Sistemas) e do Centro de Pesquisa do Câncer Alemão (DKFZ).

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais do DKFZ. Cuidado: A fim de evitar a contaminação de RNAse de amostras, tomar precauções básicas para evitar a contaminação de RNAse e preparar todos os tampões com água tratada com DEPC. 1. Preparação de gradientes de sacarose <ol><li> Prepare a 17,5, 25,6, 33,8, 41,9 e soluções de sacarose a 50% (ver Tabela 1). Comece a preparar gradientes adicionando lentamente 2 mL de solução de sacarose a 50% para o fundo de um tubo de polialómero ultracentrífuga. Congelar a camada pela colocação de tubos durante 20 minutos à temperatura de -80 ° C. </li><li> Adicione as camadas subsequentes a diminuir porcentagens de sacarose com as etapas de congelamento entre eles, acabando com até 17,5% de sacarose. Manter gradientes de gelo durante a adição de soluções de sacarose a fim de evitar que a descongelação das camadas subjacentes. </li><li> Preparar gradientes de sacarose recentemente um dia antes da utilização e manter a 4 ° C. Alternatively, preparar gradientes de antecedência, armazenar a -80 ° C e descongelamento, a 4 ° C a noite anterior à experiência. </li></ol> 2. Preparação de Tecidos (Cord e / ou cérebro espinhal) <ol><li> Anestesiar rato por uma overdose de cetamina e xilazina em NaCl e transcardialmente perfundir com 20 ml de solução de sais equilibrada de Hank (HBSS) contendo 200 ug / ml CHX que imobiliza ribossomas em transcritos associados. Confirme anesthetization adequada por não-resposta às pitadas dedo do pé. </li><li> Extrair tecido rapidamente. Abra o dorsal crânio e extrair o cérebro. Realizar laminectomia de toda a coluna vertebral torácica e lombar, e extrair a medula espinhal. Use cérebro inteiro (~ 400 mg) ou um pedaço de 4 cm da medula espinhal (~ 90 mg), respectivamente. </li><li> Transferir tecido em gelo frio homogeneização tampão A (ver Tabela 1) (medula espinal: 1 ml; cérebro: 4 ml) e dice em pedaços pequenos com um bisturi limpa para permitir o aumento da absorção de cicloheximida. Perform todos os outros passos no gelo. </li><li> Incubar durante 15 min e homogeneizar o tecido mecanicamente utilizando um homogeneizador Dounce. Homogeneização cuidadosamente controlada é necessário para assegurar que os núcleos permanecem intactos. Trate todas as amostras exatamente da mesma maneira para assegurar a comparabilidade. Nota: para o tecido cerebral: Disrupt tecido por 5 golpes com um pilão bem justa. Para tecido da medula espinhal: interromper por cinco golpes com um pilão vagamente montagem, seguidos por 5 mais golpes com um pilão bem justa. </li><li> Tome alíquotas (400 mL para o cérebro e 200 mL de medula espinhal), congelamento flash e armazenar a -80 ° C para o isolamento de RNA total. </li><li> Retirar núcleos e células ininterrupto e fragmentos de tecido através de centrifugação a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. Centrifugação a baixa velocidade evita a perda dos ribossomos. </li><li> Fragmentos de membrana Lyse no sobrenadante livre de núcleos de 30 min por adição de NP-40 e desoxicolato de sódio detergentes (cada um a uma concentração final de 1%). </li></ol><ol><li> Este passo remove componentes gordos da amostra que de outra forma mascarar o sinal no perfil polyribosome. Primeiro, baldes ultracentrífuga pré-frio e rotor a 4 ° C e preparar 2 M, 1,1 M e 0,9 M soluções de sacarose (ver Tabela 1). </li><li> Misturar com um lisado 1,22 volumes de solução 2 M de sacarose e transferir para um tubo de ultracentrífuga polietileno. Encha-se todos os tubos para igual volume de 10 ml com 1,1 M solução de sacarose, depois cobri-la com cuidado e com 0,9 M solução de sacarose. </li><li> Coloque os tubos ultracentrífuga em baldes ultracentrífuga pré-refrigerados. Centrifugar durante 3 horas a 100.000 x g a 4 ° C. Durante este processo os ribossomas se depositam no sedimento enquanto componentes gordos flutuam e permanecem no sobrenadante. </li></ol> 4. Sacarose Gradiente Fracionamento <ol><li> Remover o sobrenadante e dissolve-se o pellet em tampão de homogeneização B (ver Tabela 1 </strong&gt;). Medir a absorvância a 260 nm para cada amostra utilizando um aparelho Nanodrop ou equivalente e normalizar valores para carregar de acordo com o valor da absorvância. </li><li> Coloque gradientes de sacarose (a preparação é descrita numa secção anterior) para os baldes ultracentrífuga previamente arrefecidos. Amostras da camada cuidadosamente em cima do gradiente. Adicionar um gradiente de sacarose em branco como controle técnico. </li><li> Ajustar o peso de cada balde com o tampão de homogeneização. Centrifugue as amostras de 1,5 h a 285.000 x g a 4 ° C. </li><li> Começar a preparar a Isco fraccionador 30 minutos antes do final de centrifugação. Se um outro modelo de fraccionador é usado, seguir o protocolo do fabricante. <ol><li> Defina a sensibilidade adequada (0,2 AUFS para o cérebro ou 0,05 AUFS para medula espinhal) para a lâmpada UV e ligá-lo para aquecer. Monte o piercer tubo, conectá-lo através da bomba de rolamento para solução de sacarose 60% através do piercer tubo. </li><li> Teste a instalação por bombeamento rato sacarose (fluxoe: 1 ml / min), em particular se certificar de que não há vazamentos nas tubulações que irá introduzir bolhas no gradiente. </li><li> Absorção de fundo branco, bombeando manualmente tampão gradiente para o detector UV e correção de linha de base. </li></ol></li><li> Remova cuidadosamente os baldes ultracentrífuga contendo os gradientes de sacarose com amostras sedimentadas do rotor e colocá-los no gelo. Evite qualquer colisão de gradientes para evitar a perda de resolução. </li><li> Gradientes executado no fraccionamento. Execute gradientes vazios primeiro a avaliar absorção de fundo e garantir a configuração técnica adequada. <ol><li> Anexar gradiente para o detector de UV e perfurar o fundo do tubo com o tubo de perfurador. Iniciar o bombeamento de 60% de sacarose, o qual irá desalojar o gradiente com amostras sedimentados para cima, através do detector de UV e para a conta-gotas. </li><li> A absorvância a 260 nm está documentado para gerar o perfil de absorção da amostra, com picos que indicam a sedimentaçãoção de mRNAs associados subunidades ribossomais, monosomes e, posteriormente, aumento do número de ribossomos. </li></ol></li><li> Coletar amostras em 20 frações por meio do conta-gotas (600 mL cada, em tubos de 2 ml). </li></ol> 5. Isolamento de ARN a partir de fracções individuais <ol><li> Adicionar 10% de SDS para uma concentração final de 1% para as fracções individuais e misturar bem, a fim de se desdobrar proteínas e dissociar os ribossomas. Neste ponto, as amostras podem ser congeladas a -80 ° C. Dependendo da questão a ser abordada, frações podem ser agrupados de acordo com o perfil de absorção. </li><li> Isolar o ARN com a extracção com fenol / clorofórmio, ácido, que também remove os traços de contaminantes de ADN. <ol><li> Adicionar um volume de ácido fenol / clorofórmio (pré-aquecido até à temperatura ambiente), para cada amostra, o calor durante 10 min a 65 ° C e pressão de libertação sob a coifa depois. </li><li> Centrifugue as amostras durante 20 min a 17.000 x g à temperatura ambiente. Transferir cuidadosamente fase aquosa para um novo 1,5 mltubo. Esteja ciente de inversão de fase em frações de sacarose mais densas, onde a fase aquosa pode estar no fundo após a centrifugação. </li><li> Adicionar um volume de isopropanol, 1/9 do volume de acetato de sódio (pH 5,2) e 1 pi GlycoBlue para cada amostra, a fim de precipitar o RNA. Manter as amostras, pelo menos, 1 hora a -80 ° C. </li><li> Centrifugar durante 30 minutos a 17.000 xg e 4 ° C. GlycoBlue proporciona a visualização da pelota. Remover o sobrenadante, lavar pellet uma vez com o frio do gelo etanol 80% e ar pellet seco. Dissolver sedimento em RNAse livre água. </li></ol></li><li> Quantificar quantidade de RNA por Nanodrop e analisar a integridade do RNA por um chip Bioanalyzer. ARN, que é obtido pelo protocolo apresentado é adequado para todos os estado da arte, incluindo ensaios de elevado rendimento de microarray e sequenciação de profundidade. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis.">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li><li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., Schlaeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation.">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 1, (2011).</li><li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes:+postnatal+development+and+experimental+demyelination.">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li><li>Larocca, J. N., Norton, W. T., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+myelin.">Isolation of myelin.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 3, (2007).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135 (4), 738-748 (2008).</li><li>Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues.">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. a., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

Não há conflito de interesse declarados.

Embora polyribosome fracionamento não é uma técnica nova, continua a ser um particularmente desafiador. Com base no material de entrada, a otimização substancial pode ser necessário. Este é especialmente o caso para amostras in vivo do SNC, onde a quantidade de material é muitas vezes uma limitação e componentes do tecido adiposo dificultar o isolamento de mRNAs de tradução. Mais fraccionamento protocolos publicados lidam com a levedura ou as linhas de células de mamíferos, e existem protocolos estabelecidos para o cérebro 12,13,14. Em contraste, há quase todas as publicações que descrevem fracionamento das medulas espinhais e protocolos anteriores exigem medula espinhal de um grande número de animais a serem agrupados 15. Por estes motivos, várias modificações essenciais foram feitas para adaptar o protocolo de fraccionamento para os tecidos do SNC, incluindo o único rato medula espinhal. Imobilização ribossomo com cicloheximida é realizada durante a perfusão animal para evitar a dissociação dos ribossomos during o longo processo de extração do tecido. Subsequentemente, os ARN polissomal são extraídos de uma forma específica para maximizar o rendimento polyribosome. Em primeiro lugar, a homogeneização do tecido controlada pelo douncing, mantém o núcleo intacto e evita a contaminação do ADN. O núcleo é então removido de forma fiável por centrifugação. A combinação dos detergentes NP-40 e desoxicolato de sódio assegura lise do retículo endoplasmático e de libertação das suas membranas associadas ribossomas. Além disso, os componentes de absorção de UV na mielina lipídico rico obscurecer os perfis polyribosome. Mielina flotação é, portanto, necessário, em que os compostos densos, tais como polirribossomas são sedimentadas e compostos mais leves, tais como a mielina flutuador e são removidos 16. Polirribossomos são então sedimentadas sobre um gradiente de sacarose de 17,5% para 50%. Em vez de camadas manualmente e congelando cada camada de sacarose, gradientes também pode ser preparado utilizando um misturador de gradiente. A extracção de ARN a partir de fracções usando ácido fenol / clorofórmio permite DNA a ser removido com a perda mínima de ARN. No entanto, a inversão de fases pode ocorrer em fracções de sacarose e densas (acima fracção 16). Este protocolo oferece vantagens sobre os outros métodos convencionais que se dirigem ao nível da tradução. Por exemplo, tanto a medida de fosforilada S6 (um marcador de tradução de destaque), bem como a rotulagem das cadeias nascentes com radioisótopos dão informações sobre os níveis de tradução global mas revelam pouco sobre o que está especificamente a ser traduzido. Polyribosome fraccionamento, por outro lado, permite não só a avaliação da tradução global, mas também da identidade do traduzindo ARNm e as proteínas reguladoras associadas. PCR quantitativa em tempo real pode ser realizada em ARN isolado de uma leitura rápida de ARNm seleccionados, e microarranjos e próxima geração de sequenciação de ARN pode ser realizada por estudos de genoma. As optimizações aqui apresentados permitem a técnica a ser usado com uma quantidade mínima de tecidos do SNC, por conseguinte, diminuirção do número de animais necessários e melhorar a qualidade global experimental, reduzindo o tempo de processamento do tecido. Por outro lado, esta técnica não pode distinguir ribossomos paralisadas desde as traduzindo. Transcrições transportando ribossomos paralisadas sedimenta nas frações pesadas, e isso deve ser mantido em mente ao interpretar os dados. Existem técnicas relatadas, nomeadamente RiboTaq e armadilha, em que os ribossomos são marcadas com etiquetas de epitopos ou repórteres respectivamente de uma maneira específica tipo de célula e mRNAs isolados por imunoprecipitação 17,18 associados. Esta técnica pode ser acoplado a polyribosome fraccionamento para oferecer alta resolução lido para populações de células específicas. Ribossomo pé-impressão é uma outra nova técnica que envolve a digestão nuclease para gerar pequenos fragmentos, ou &quot;pegadas&quot;, de mRNAs que são protegidos por ribossomos. Bibliotecas são então gerados a partir dessas pegadas e seqüenciados. Este método provides toda uma análise do genoma específico do códon de tradução e é capaz de identificar os ribossomos paralisadas, não-agosto começam códons e pequenos quadros de leitura aberta a montante, que não podem ser alcançados por polyribosome fracionamento 19. No entanto, polyribosome fraccionamento pode ser acoplado ao perfil de ribossoma para o isolamento dos fragmentos digeridos individuais contendo ribossomas, enriquecendo assim para as espécies moleculares necessários para a preparação da biblioteca em que a alta pureza da amostra é muitas vezes necessário. Tomados em conjunto, polyribosome fracionamento é um método flexível, com significado duradouro e pode ser acoplado a várias aplicações a jusante, incluindo amplos ensaios genoma como sequenciamento de última geração.

A expressão de genes é determinado pela acção combinada de transcrição, tradução e estabilidade de ARNm e proteínas, com tradução tendo o efeito mais predominante 1. É agora evidente que cada um destes passos é altamente regulado. Micro-RNAs, a formação de grânulos de RNA, alternativa e poliadenilação citoplasmática são alguns exemplos de regulação pós-transcricional da expressão gênica 2,3. Cada um destes mecanismos de transcrição desacopla da tradução e influencia o proteoma do sistema biológico de interesse. Assim, sem surpresa, os níveis de mRNA por si só são uma leitura imperfeita dos níveis de proteína 4. Proteômica quantitativa fornece a avaliação mais direta da expressão do gene, no entanto, apesar dos avanços recentes, ainda há limitações consideráveis ​​na sensibilidade e resolução seqüência da proteína. Portanto, a abordagem translatome, o repertório de mRNAs traduzindo, oferece um excelente compromisso entre o estudo datranscriptoma e proteoma. É mais preciso do que transcriptomics em avaliar a expressão gênica final, e fornece maior cobertura e resolução seqüência de proteômica. Em sistemas de mamíferos, a maioria dos eventos de tradução começar via iniciação dependente do cap. Um grupo de factores de iniciação eucarióticas conjuntamente com a subunidade ribossomal 40S montar a tampa de extremidade 5 &#39;de um mRNA. O complexo, em seguida, verifica o mRNA e ao chegar ao início códon agosto, recruta a subunidade ribossômica 60S para formar uma completa 80S dos ribossomas. O alongamento da fase prossegue com o ribossoma se deslocam ao longo do mRNA, com factores de alongamento auxiliar a incorporação de aminoácidos a partir de ARNt carregados para a cadeia de péptido nascente. Várias ribossomas pode prosseguir ao longo de um único mRNA, simultaneamente, e o número de ribossomas associados foi demonstrado haver uma correlação com a taxa de síntese de proteína de 5,6. Isso faz com que o carregamento ribossômica uma indicação fiável para translation e permite a separação de traduzir ARNm activamente com base na taxa de sedimentação. Além disso a quantificação de traduzir ARNm, a informação da sequência pode ser obtida para identificar motivos envolvidos na regulação de tradução. RNA também proteínas de ligação e outros factores de tradução podem ser isolados a partir de diferentes fracções, facilitando o estudo e descoberta de proteínas reguladoras associadas. No sistema nervoso, o controlo da tradução foi ligada a processos, tais como a armazenagem de ARNm, o transporte e síntese de proteínas local. Cones de crescimento têm sido mostrados para abrigar uma piscina específica localizada do ARNm distintas do resto do axónio 7. Além disso, os axónios possuem a capacidade de sintetizar localmente proteínas 8,9. Como resultado, o controle local da tradução se tornou um tema crucial do estudo em neurobiologia. O potencial de polyribosome fraccionamento para resolver este tenha sido ilustrada em vários estudos, nos quais foi utilizada a técnica deinvestigar orientação axônio no desenvolvimento da medula espinhal, e demonstrou a tradução dependente de atividade de BDNF no cérebro 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Hank&#8217;s balanced salts solution</td>
			<td style="width:147px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14170-138</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonidet P-40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332473001</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlycoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538/357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x&#160;g</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Density Gradient Fractionator</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation

Vários processos estão envolvidas na expressão de genes, incluindo a transcrição, tradução e estabilidade de ARNm e proteínas. Cada uma dessas etapas são fortemente regulados, afetando a dinâmica finais da abundância de proteínas. Existem vários mecanismos de regulação na etapa de tradução, tornando os níveis de mRNA só um indicador fiável da expressão gênica. Além disso, a regulação local da tradução do mRNA tem sido particularmente implicado em funções neuronais, mudando &#39;translatomics&#39; para o foco de atenção em neurobiologia. O método apresentado pode ser usado para transcriptomics ponte e proteômica. Aqui nós descrevemos modificações essenciais para a técnica de fracionamento polyribosome, que interroga o translatome baseada na associação de mRNAs ativamente traduzido para vários ribossomos e sua sedimentação diferencial em gradientes de sacarose. Tradicionalmente, o trabalho com em amostras in vivo, particularmente do Central sistema nervoso central (SNC), tem se mostrado um desafio devido às quantidades limitadas de material ea presença de componentes de tecido adiposo. A fim de solucionar este problema, o protocolo descrito é especificamente optimizado para utilização com uma quantidade mínima de material de CNS, como demonstrado pela utilização de um único rato medula espinal e do cérebro. Resumidamente, os tecidos do SNC são extraídos e ribossomas traduzindo são imobilizados em mRNAs com ciclo-heximida. Mielina flutuação é então realizada para remover lipídeos componentes ricos. O fraccionamento é realizado em um gradiente de sacarose em que os mRNAs são separados de acordo com a sua carga ao ribossoma. As frações isoladas são adequados para uma série de ensaios a jusante, incluindo as novas tecnologias de análise do genoma de largura.

A Figura 2 mostra os perfis representativos polyribosome após fraccionamento. Os perfis de cérebro e medula espinal mostram as curvas de absorção características tal como descrito antes para as linhas celulares. mRNAs ligados a pequenas subunidades ribossomais (40S) de sedimentos de fracções mais leves e aparece em primeiro lugar como um pico no perfil, seguido da grande subunidade ribossomal (60s) e (80S) monosome mRNAs ligados. mRNAs ligados a vários ribossomos sedimentos em fracções mais pesadas, com os picos mais tarde indicando aumento do número de ribossomos ligados. Tradução global pode ser avaliada a partir do perfil. Como um exemplo, o tecido cerebral tem um polyribosome superior a monosome proporção do que o tecido da medula espinal, indicando mais activa de tradução. ARN extraído de fracções individuais foram avaliadas por Bioanalyzer, mostrando a distribuição de 18S e 28S rRNA. 18S rRNA aparece mais cedo no perfil, de acordo com as pequenas subunidades ribossomais sedimente em sucr isqueiro<html> frações OSE. Os rendimentos típicos de ARN total são de 10-20 ug de cérebro e 2-4 ug de medula espinhal. Rendimentos de ARN a partir de fracções individuais são de até 4 mg e 0,8 mg de cérebro e medula espinal, respectivamente, em função da fracção. Um gradiente de sacarose em branco já mostra alguma absorção de fundo a 260 nm, devido à presença de DTT. Este fundo pode ser subtraída durante a análise de dados, a fim de normalizar os valores da amostra. Tratamento com EDTA colapso dos picos polyribosome, demonstrando o perfil de sedimentação é devido à tradução. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Workflow e aplicações potenciais in vivo polyribosome fracionamento.&gt; Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> Perfis Figura 2. (A) Perfis polyribosome típicas do cérebro e da medula espinhal, com a avaliação de RNA extraído por Bioanalyzer. (B) Distribuição do ARNm de GAPDH sobre fracções por qRT-PCR. (C) Polyribosome de gradiente vazio e cérebro com e sem tratamento EDTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> Tampão gradiente 2x </td><td> 30 mM Tris-HCl pH 7,4, 30 mM de MgCl 2, 600 mM de NaCl, 200 ug / ml de ciclo-heximida (CHX), 2 mM de ditiotreitol (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> a solução de sacarose de 17,5% </td><td> 8,67 g de sacarose, 25 ml de 2 x tampão de gradiente, de até 50 ml de H 2 0 DEPC </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> a solução de sacarose de 25,6% </td><td> 12,8 g de sacarose, 25 ml de 2 x tampão de gradiente, de até 50 ml de H 2 0 DEPC </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> a solução de sacarose de 33,8% </td><td> 16,9 g de sacarose, 25 ml de 2 x tampão de gradiente, de até 50 ml de H 2 0 DEPC </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solução de sacarose de 41,9% </td><td> 20,95 g de sacarose, 25 ml de 2 x tampão de gradiente, de até 50 ml de H 2 0 DEPC </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solução de sacarose a 50% </td><td> 25 g de sacarose, 25 ml de 2 x tampão de gradiente, de até 50 ml de H 2 0 DEPC </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> homogeneizaçãotampão A </td><td> 0,25 M de sacarose, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4), MgCl2 5 mM, KCl 25 mM </td><td> 200 ug / ml de CHX, 1x Roche inibidor de protease completo, DTT 1 mM, phenylmethanesulfonylfluoride 1 mM (PMSF), 100 U / ml de RNAsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> Solução de sacarose 2M </td><td> 68,4% de sacarose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, MgCl2 5 mM, KCl 25 mM </td><td> 100 ug / ml de CHX, 1x Roche inibidor de protease completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1.1M solução de sacarose </td><td> 38,5% de sacarose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, MgCl2 5 mM, KCl 25 mM </td><td> 100 ug / ml de CHX, 1x Roche inibidor de protease completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0.9M solução de sacarose </td><td> 30,8% de sacarose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, MgCl2 5 mM, KCl 25 mM </td><td> 100 ug / ml de CHX, 1x Roche inibidor de protease completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> homogenization tampão B </td><td> 0,25 M de sacarose, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4, 5 mM de MgCl 2, 25 mM de KCl, 1% de NP-40, desoxicolato de sódio a 1% </td><td> 200 ug / ml de CHX, 1x Roche inibidor de protease completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, 100 U / ml de RNAsin </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Lista de tampões e soluções.

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In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Este protocolo ilustra modificações essenciais da polyribosome fraccionamento, a fim de estudar o translatome in vivo de amostras do SNC. Ele permite que a avaliação global de tradução e transcrição regulação através do isolamento e comparação de RNA total para ribossomo frações de RNA ligado.

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

12.2K visualizações.  German Cancer Research Center (DKFZ).  Este protocolo ilustra modificações essenciais da polyribosome fraccionamento, a fim de estudar o translatome in vivo de amostras do SNC. Ele permite que a avaliação global de tradução e transcrição regulação através do isolamento e comparação de RNA total para ribossomo frações de RNA ligado. 

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Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Transecção do nervo óptico: Um Modelo de Apoptose Neuron Adultos no Sistema Nervoso Central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Neurociência

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Um Paradigma para Investigar Lesão de reparação do sistema nervoso central em<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Entrega intraventricular direta de medicamentos para o Sistema Nervoso Central Rodent

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

Avaliação Funcional de neurotoxinas Biológica em Culturas em Rede de Células-Tronco derivadas do Sistema Nervoso Central Neurônios

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing óptica do Sistema Nervoso Central Rato Usando a claridade passiva

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...