A terapia fotodinâmica, PDT, oferece várias vantagens para o tratamento do câncer, e sua eficácia depende de uma fonte de luz para ativar um fotossensibilizador. Apesar dos recentes avanços no campo, há uma falta de acesso a um dispositivo caro e reprodutível para PTD para modelos in vitro. Para atender a essa demanda, este trabalho descreve um dispositivo novo, simples e de baixo custo para realizar ensaios de TFD em culturas celulares, denominado PhotoAct.
Para iniciar a construção, viu placas de fibra de média densidade de três milímetros de espessura, MDF, para obter peças com as seguintes dimensões. Crie duas caixas com as seguintes dimensões. Perfure a parte de trás da caixa maior para instalar um conector de tomada de barril.
Além disso, perfure a parte superior da caixa maior, a parte superior e a parte inferior da caixa menor para fornecer uma passagem para cabos elétricos. Pinte todas as superfícies internas com tinta preta para promover a incidência de luz homogênea. Anexe em paralelo três fitas LED com 10 LEDs cada na superfície interior superior da caixa menor.
Além disso, instale um sensor de brilho no centro da superfície interior inferior da caixa menor. Imprima a estrutura da unidade de controle usando o arquivo de impressão 3D suplementar. Instale todos os componentes, botão liga/desliga, potenciômetros, touchpad de início de tempo, LEDs, sensor de brilho, LCD, campainha e fonte de alimentação, e as partes de uma placa controladora ESP-32 montada no interior da unidade de controle.
Carregue o código de programação disponível no arquivo suplementar e execute um teste para verificar se todas as conexões estão funcionando. Monte as caixas e fixe-as juntas para evitar lacunas e, consequentemente, interferência de iluminação externa e perda imediata de luz. Anexe a unidade de controle montada à área perfurada na parte superior do protótipo.
Construa uma porta da frente do mesmo material nas seguintes dimensões e fixe-a na caixa externa com dobradiças e fitas Velcro para garantir o fechamento da câmara e ensaios ininterruptos. Instale também uma maçaneta para manipular a porta da frente com facilidade e precisão. Anexe quatro almofadas de borracha na parte inferior do protótipo para garantir mais estabilidade durante as operações.
Cultivar linhagem celular HeLa no Dulbecco's Modified Eagle Medium de baixa glicose com 10% de soro fetal bovino e 1% de gentamicina. Mantenha os frascos de cultura a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius. Gerenciar e inspecionar a cultura celular até atingir 80 a 90% de confluência.
Inicie o protocolo de viabilidade celular com o processo de semeadura. Retirar o meio do balão com cultura de células HeLa confluentes. Lavar o balão com solução salina tampão fosfato, PBS, e separar a cultura com tripsina seguindo os detalhes destacados.
Conte as células ressuspensas com um hemocitômetro e semeie-as em uma microplaca de vários poços na concentração de 20.000 células por poço. Prepare duas placas para condições escuras e claras de tratamento e incube-as por 24 horas até a fixação celular. Para prosseguir com o tratamento com um fotossensibilizador, remova o meio de ambas as placas e trate as células com 100 microlitros de concentrações crescentes de Verteporfina.
Mantenha as células em tratamento por 24 horas para permitir a internalização da Verteporfina. Após a incubação, remova o tratamento, lave as células com PBS e adicione o meio livre de drogas. Cubra uma microplaca com papel alumínio para protegê-la da exposição à luz e incube-a por 24 horas.
Esta microplaca oferecerá dados de controle para uma análise mais aprofundada dos resultados da TFD. A outra microplaca será utilizada em condição de exposição à luz no PhotoAct. Para operar o equipamento, conecte-o à tomada e ligue-o, pressionando o botão liga/desliga.
Coloque a microplaca de vários poços na câmara PDT e feche o equipamento prendendo a porta frontal com as fitas laterais Velcro. Para configurar o equipamento, use os potenciômetros para ajustar a configuração RGB da emissão de luz. Pressione o touchpad de mais/menos para ajustar a configuração de tempo e definir a duração do ensaio.
Verifique se as informações corretas sobre o ensaio são mostradas no visor e faça os ajustes finais, se necessário. Pressione o touchpad inicial para iniciar o ensaio. Uma campainha de um bipe deve ser ouvida no início do experimento.
Durante o experimento, informações de progresso podem ser observadas na tela, como irradiância e tempo restante. Não abra a porta da frente nem altere qualquer configuração durante o ensaio PDT. No final do ensaio, uma campainha de quatro bipes deve ser ouvida e o sistema eletrônico desligará todos os LEDs.
Uma mensagem finalizada e a quantidade final de energia expandida durante o experimento podem ser observadas no visor. O valor final da fluência é calculado de acordo com a equação destacada. Cubra a microplaca que sofreu exposição à luz e prossiga com a incubação de 24 horas.
Após o período de incubação, remova o meio de ambas as placas, lave a monocamada de células com PBS e adicione a solução de MTT. Incubar ambas as placas em condições escuras e claras por quatro horas para permitir a formação de cristais formazan. Remova cuidadosamente a solução de MTT e dissolva os cristais roxos com uma solução de DMSO e etanol.
Após a dissolução completa dos cristais, realizar a medição da absorbância utilizando um leitor de microplacas a 595 nanómetros. O produto final consiste em uma câmara escura com sua superfície interior superior equipada com um conjunto de 30 diodos emissores de luz dispersos, LEDs, programados para emitir espectros distintos de luz visível. Uma incidência de luz homogênea é estabelecida devido à baixa refletividade das superfícies interiores e à distribuição uniforme da configuração dos LEDs.
A interface de configuração é fácil de usar e a condição experimental estabelecida foi reprodutível. Como prova de conceito, o dispositivo foi usado para aumentar o efeito citotóxico da verteporfina em cultura de células HeLa 2D após exposição à luz. Como mostrado na figura, o valor de GI50 foi de 3,1 micromolares para a condição de luz.
e 13,8 micromolares para a condição escura Portanto, o aumento de mais de quatro vezes na eficiência comparando as condições confirma o uso da Verteporfina como fotossensibilizador e a aplicabilidade do PhotoAct nos ensaios de TFD. Para validar o uso do protótipo descrito neste trabalho, um dispositivo PDT comercial foi utilizado nas mesmas condições experimentais, incluindo fotossensibilizador, células e fluência, e os resultados foram comparados. Como mostrado na figura, ambos os dispositivos fotoativaram a Verteporfina igualmente, aumentando o efeito citotóxico.
Finalmente, a morte celular mediada por EROs desencadeada pela Verteporfina após a exposição à luz foi confirmada por citometria de fluxo usando o ensaio DCFDA. Em resumo, o dispositivo foi facilmente construído com componentes de baixo custo comercialmente disponíveis com um custo total de menos de 50. As principais outras vantagens do dispositivo incluem portabilidade, baixa demanda de manutenção, capacidade de irradiar vários tipos de placas de cultura, o uso simultâneo de até quatro unidades por ensaio, irradiação precisa e reprodutível, interface de configuração fácil de usar e simples que não requer conexão com computadores ou outras máquinas.
Além disso, um fluxograma de decisão é apresentado para fornecer uma abordagem sistemática de resolução de problemas para encontrar e corrigir problemas ou erros durante a operação. Estes resultados permitem alargar os benefícios do PhotoAct para facilitar a TFD à investigação científica, explorando o mecanismo de ação dos fotossensibilizadores e as suas aplicações clínicas.
