Este método pode ser útil em imagens de plantas inteiras para revelar morfologia intacta, processos de desenvolvimento e interações entre plantas e micróbios. A principal vantagem desta técnica é que podemos observar diretamente o interior de um corpo vegetal sem infligir danos a ele. Como este método se aplica a uma ampla gama de espécies e tecidos vegetais, pode ajudar a acelerar a descoberta de novos fenômenos na pesquisa biológica vegetal.
A fixação é um passo crítico neste procedimento. Antes da etapa de compensação, é preciso verificar a intensidade da proteína fluorescente após a fixação. Para começar a mergulhar amostras de plantas na solução fixativa em um micro tubo, e garantir que o volume da solução fixa é mais de cinco vezes o volume amostral.
Sele o micro tubo com um parafilm e faça furos usando uma agulha. Coloque o micro tubo em um dessecator e ajuste lentamente o grau de vácuo para cerca de 690 milímetros de mercúrio para que as bolhas apareçam gradualmente a partir das amostras. Desligue a bomba de vácuo depois de evacuar o desiccator.
Desabascar o desiccate cuidadosamente sem perturbar as amostras. Ligue novamente a bomba de vácuo e desligue-a depois de evacuar o desiccador. Abra o desiccator cuidadosamente sem colidir com a solução fixativa no microtubo.
Remova a solução fixa e adicione 1x PBS com uma micro pipeta. Depois de armazenar por um minuto, substitua o PBS antigo por novo PBS 1x. Depois de remover o PBS em cinco vezes o volume amostral da solução de compensação, sele o micro tubo com parafilme e faça furos com uma agulha.
Coloque as amostras no desiccator. Evacuar e desligar a bomba de vácuo. Abra o desiccador suavemente e feche o microtubo.
Inverta o micro tubo, a cada um ou dois dias para acelerar o processo de limpeza. Para a estrutura espaçadora, corte uma folha de borracha de silicone com uma lâmina de barbear ajustando a espessura da folha de borracha de silicone de acordo com a espessura da amostra. Coloque a estrutura de silicone em um vidro de cobertura, em seguida, coloque as amostras tratadas dentro da estrutura e adicione cerca de 100 microliters de solução de compensação para remover quaisquer bolhas.
Cubra com outro vidro de cobertura para evitar a evaporação da solução de compensação. Observe as amostras sob um microscópio fluorescente. Após observação, devolva as amostras para a solução de limpeza em um microtubo.
Folhas fixas de várias espécies foram incubadas em PBS ou ClearSee por oito dias, em ClearSee ou ClearSeeAlpha por dois dias. ClearSee pode limpar folhas de várias espécies. Depois de extrair o cuticular, ClearSee poderia limpar folhas de arroz.
Como o componente sulfite de sódio em ClearSeeAlpha previne a oxidação de polifenóis devido ao efeito de redução, o ClearSeeAlpha poderia limpar tabaco e tirania pistils sem qualquer pigmentação marrom. As folhas de Ubiquitin-10 promotor H2B-mClover de arabidopsis thaliana foram tratadas com PBS ou ClearSee por três dias. O tratamento ClearSee reduziu a cor verde pálida da folha arabidopsis H2B-mClover e aprimora a intensidade de fluorescência de H2B-mClover em comparação com a incubação pbs.
As folhas tratadas clearSee foram observadas por microscopia de excitação de dois fótons com excitação de 950 nanômetros. A parede celular está manchada com calcaflour-white. Os núcleos são rotulados com o promotor ubiquitin-10, H2B-mClover.
As imagens Y Z e X Z são seções transversais na posição indicada pelas linhas brancas tracejadas. A preparação da solução fixa é importante para corrigir as amostras. No entanto, deve-se tomar cuidado para evitar danos às amostras sob vácuo.
Imagens microscópicas podem ser realizadas para estudar múltiplos padrões de expressão genética e comunicações intracelulares durante o desenvolvimento e infecção da planta após este procedimento.
