Diese Methode kann in der Ganzpflanzenbildgebung hilfreich sein, um intakte Morphologie, Entwicklungsprozesse und Wechselwirkungen zwischen Pflanze und Mikrobe aufzudecken. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir das Innere eines Pflanzenkörpers direkt beobachten können, ohne ihn zu beschädigen. Da diese Methode auf eine Vielzahl von Pflanzenarten und -geweben angewendet wird, kann sie dazu beitragen, die Entdeckung neuer Phänomene in der pflanzenbiologischen Forschung zu beschleunigen.
Die Fixierung ist ein kritischer Schritt in diesem Verfahren. Vor dem Clearing-Schritt muss man die Intensität des fluoreszierenden Proteins nach der Fixierung überprüfen. Um zu beginnen, tauchen Sie Pflanzenproben in die fixierende Lösung in einem Mikroröhrchen und stellen Sie sicher, dass das Volumen der fixativen Lösung mehr als das Fünffache des Probenvolumens beträgt.
Verschließen Sie das Mikroröhrchen mit einem Parafilm und machen Sie Löcher mit einer Nadel. Legen Sie das Mikroröhrchen in einen Exsikkator und stellen Sie den Vakuumgrad langsam auf etwa 690 Millimeter Quecksilber ein, so dass allmählich Blasen aus den Proben entstehen. Schalten Sie die Vakuumpumpe aus, nachdem Sie den Exsikkator evakuiert haben.
Entlüften Sie das Trockenmittel vorsichtig, ohne die Proben zu stören. Schalten Sie die Vakuumpumpe wieder ein und schalten Sie sie nach der Evakuierung des Exsikkators aus. Öffnen Sie den Exsikkator vorsichtig, ohne die Fixierlösung im Mikroröhrchen zu stoßen.
Entfernen Sie die Fixierlösung und fügen Sie 1x PBS mit einer Mikropipette hinzu. Nachdem Sie eine Minute gelagert haben, ersetzen Sie den alten PBS durch den neuen 1x PBS. Nachdem Sie PBS mit dem Fünffachen des Probenvolumens der Clearinglösung entfernt haben, verschließen Sie das Mikroröhrchen mit Parafilm und machen Sie Löcher mit einer Nadel.
Legen Sie die Proben in das Exsikkator. Evakuieren und schalten Sie die Vakuumpumpe aus. Öffnen Sie den Exsikkator vorsichtig und schließen Sie dann das Mikroröhrchen.
Invertieren Sie das Mikroröhrchen alle ein bis zwei Tage, um den Clearing-Prozess zu beschleunigen. Schneiden Sie für den Abstandshalterrahmen eine Silikongummiplatte mit einer Rasierklinge und passen Sie die Dicke der Silikonkautschukfolie entsprechend der Probendicke an. Legen Sie den Silikonrahmen auf ein Deckglas, legen Sie dann die behandelten Proben in den Rahmen und fügen Sie etwa 100 Mikroliter Klärlösung hinzu, um Blasen zu entfernen.
Mit einem weiteren Deckglas abdecken, um ein Verdampfen der Räumlösung zu verhindern. Beobachten Sie die Proben unter einem fluoreszierenden Mikroskop. Nach der Beobachtung werden die Proben in einem Mikroröhrchen in die Klärlösung zurückgeführt.
Feste Blätter verschiedener Arten wurden acht Tage lang in PBS oder ClearSee inkubiert, in ClearSee oder ClearSeeAlpha zwei Tage lang. ClearSee kann Blätter verschiedener Arten entfernen. Nach der Extraktion der Nagelhaut konnte ClearSee Reisblätter entfernen.
Da die Natriumsulfitkomponente in ClearSeeAlpha aufgrund der reduzierenden Wirkung eine Polyphenoloxidation verhindert, könnte ClearSeeAlpha Tabak- und Tirantia-Stempel ohne braune Pigmentierung entfernen. Ubiquitin-10 Promotor H2B-mClover Blätter von Arabidopsis thaliana wurden drei Tage lang mit PBS oder ClearSee behandelt. Die ClearSee-Behandlung reduzierte die blassgrüne Farbe des Arabidopsis H2B-mClover-Blattes und erhöhte die Fluoreszenzintensität von H2B-mClover im Vergleich zur PBS-Inkubation.
Die mit ClearSee behandelten Blätter wurden mittels Zwei-Photonen-Anregungsmikroskopie mit 950-Nanometer-Anregung beobachtet. Die Zellwand ist mit kalcamehl-weiß gefärbt. Kerne sind mit Ubiquitin-10-Promotor, H2B-mClover, gekennzeichnet.
Die Bilder von Y Z und X Z sind Querschnitte an der Position, die durch die weiß gestrichelten Linien angezeigt wird. Die Vorbereitung der fixativen Lösung ist wichtig, um die Proben zu fixieren. Es sollte jedoch darauf geachtet werden, dass Schäden an den Proben unter Vakuum vermieden werden.
Eine mikroskopische Bildgebung kann durchgeführt werden, um mehrere Genexpressionsmuster und intrazelluläre Kommunikation während der Pflanzenentwicklung und -infektion nach diesem Verfahren zu untersuchen.
