この方法は、無傷の形態、発生過程、および植物と微生物の相互作用を明らかにするために、植物全体のイメージングにおいて有用であり得る。この技術の主な利点は、植物体に損傷を与えることなく、植物体の内部を直接観察できることです。この方法は、幅広い植物種および組織に適用されるため、植物生物学的研究における新しい現象の発見を加速させるのに役立つ可能性がある。
固定は、この手順の重要なステップです。クリアリングステップの前に、固定後の蛍光タンパク質の強度を確認する必要があります。マイクロチューブ内の固定液に植物試料を浸漬し始め、固定液の体積が試料体積の5倍以上であることを確認する。
マイクロチューブをパラフィルムでシールし、針を使って穴を開けます。マイクロチューブをデシケーターに入れ、真空度を約690ミリメートルの水銀にゆっくりと調整して、サンプルから泡が徐々に現れるようにします。デシケーターを排気した後、真空ポンプの電源を切ります。
サンプルを乱すことなく、乾燥剤を慎重に通気します。真空ポンプの電源を再び入れ、デシケーターを排気した後に電源を切ります。固定液をマイクロチューブにぶつけずにデシケーターを慎重に開きます。
固定液を取り出し、マイクロピペットで1x PBSを加えます。1分間保存した後、古いPBSを新しい1x PBSと交換します。透明化液のサンプル量の5倍でPBSを除去した後、マイクロチューブをパラフィルムで密封し、針で穴を開ける。
サンプルをデシケーターに入れます。真空ポンプを排気し、電源を切ります。デシケーターを静かに開き、マイクロチューブを閉じます。
マイクロチューブを1〜2日ごとに反転させて、クリアリングプロセスを加速します。スペーサーフレームの場合は、シリコーンゴムシートをカミソリ刃で切断し、試料厚みに合わせてシリコーンゴムシートの厚みを調整します。シリコーンフレームをカバーガラスの上に置き、処理したサンプルをフレーム内に置き、約100マイクロリットルの透明化溶液を加えて気泡を除去します。
透明化液の蒸発を防ぐために、別のカバーガラスで覆います。蛍光顕微鏡でサンプルを観察します。観察後、サンプルをマイクロチューブ内の透明化溶液に戻す。
様々な種の固定葉をPBSまたはClearSeeで8日間、ClearSeeまたはClearSeeAlphaで2日間インキュベートした。クリアシーは様々な種の葉をきれいにすることができます。クチクラを抽出した後、ClearSeeは米の葉をきれいにすることができました。
ClearSeeAlphaの亜硫酸ナトリウム成分は還元効果によりポリフェノールの酸化を防ぐため、ClearSeeAlphaは茶色の色素沈着なしにタバコやチラニアの雌しべをきれいにすることができます。ユビキチン−10プロモーターH2B−mCloverシロイヌナズナの葉をPBSまたはClearSeeで3日間処理した。ClearSee処理は、シロイヌナズナH2B-mClover葉の淡い緑色を減少させ、PBSインキュベーションと比較してH2B-mCloverの蛍光強度を増強した。
ClearSee処理した葉は、950ナノメートル励起を有する2光子励起顕微鏡によって観察された。細胞壁はカルカフラワーホワイトで染色される。核はユビキチン-10プロモーターH2B-mCloverで標識されている。
なお、YZ画像及びXZ画像は、白破線で示す位置の断面である。固定液の調製は、試料を固定するために重要である。ただし、真空下でのサンプルの損傷を防ぐために注意する必要があります。
顕微鏡イメージングは、この手順に従って、植物の発生および感染中の複数の遺伝子発現パターンおよび細胞内通信を研究するために行うことができる。
