Este sistema organoide do ducto biliar biliar de murina extraheptica pode abordar o acesso limitado a modelos de cholangiopatias pré-clínicos e as limitações de células-tronco pluripotentes e modelos organoides de colangiocito derivados do fígado. Nosso modelo é específico de tecido adulto, reducionista, reprodutível, tempo e custo-benefício. Será de benefício especial para laboratórios que não têm acesso a tecidos humanos.
Nossa técnica permite a colheita de um número quase ilimitado de colangiocitos extraháticos do ducto biliar para estudar a regeneração tecidual e as interações célula-célula. Demonstrando o procedimento será Junya Shiota, uma pós-doutora do meu laboratório. Para o isolamento do ducto biliar intraháptico, coloque o camundongo adulto em uma posição supina e abra a cavidade abdominal ao longo da linha média.
Retraia o fígado para descansar no diafragma e use um hemostato para puxar suavemente o duodeno proximal para revelar o ducto biliar comum imediatamente abaixo do hilum do fígado. Use um bisturi para separar o ducto biliar extrahático dos tecidos circundantes. Segurando a extremidade proximal do ducto biliar comum com fórceps, disseque o duto distally logo acima de sua conjuntura com o duodeno antes de dissecar a extremidade proximal do duto do fígado.
Coloque imediatamente o ducto biliar extraháptico isolado em uma placa de vidro contendo tampão de lavagem frio no gelo, depois limpe o ducto biliar do tecido circundante e pica-se em seções de 0,5 milímetros. Quando todo o tecido tiver sido picado, transfira as seções para um tubo contendo 500 microliters de tampão de dissociação para uma incubação de 20 minutos a 37 graus Celsius. No final da dissociação, neutralize o tampão com 500 microliters de cultura de células geladas média e tritura a suspensão do tecido 20 vezes através de uma agulha de calibre 18 e, em seguida, 20 vezes através de uma agulha de calibre 20.
Em seguida, filtrar a suspensão celular resultante através de um filtro de célula de 70 micrômetros em um tubo de 50 milímetros. Para estabelecer uma cultura organoide biliar, coletar as células por centrifugação e remover cuidadosamente o supernatante. Resuspenque a pelota em um mililitro de PBS gelado e estéril e transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro para uma segunda centrifugação.
Resuspenja a pelota lavada em 120 microliters de matriz de porão liquefeito e gelada e placa de 40 microliters de células no centro de cada um dos três poços de uma placa de 37 graus Celsius aquecida, 24-well, em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura tecidual de 37 graus Celsius por cerca de 15 minutos. Quando a matriz do porão se solidificar, adicione 600 microlitadores de 37 graus Celsius semeando meio a cada poço antes de devolver a placa à incubadora. Após três dias e a cada três dias depois, substitua o meio de semeadura por 600 microlitros de meio de cultura organoide fresco, monitorando o crescimento organoide regularmente por um microscópio invertido.
Para passar as culturas extrahepépticas do ducto biliar, pipeta os organoides em cada poço com 400 microliters de PBS gelado 10 vezes por poço antes de transferir o conteúdo do poço para tubos individuais de 1,5 mililitro. Passe cada mistura através de uma agulha de calibre 25 quatro vezes para dissociar os organoides e coletar as células por centrifugação. Em seguida, resuspende as células na matriz do porão na proporção apropriada para re-chapeamento.
Para armazenamento organoide de ducto biliar extrahepático de longo prazo, lave cada poço de organoides com PBS de temperatura ambiente sem perturbar as gotas da matriz do porão e adicione 500 microliters de meio de congelamento gelado a cada poço. Levemente resuspenque os organoides e transfira a mistura em frascos criogênicos individuais, em seguida, coloque os frascos a menos 80 graus Celsius por 48 horas antes de transferir os organoides para um tanque de nitrogênio para armazenamento a longo prazo em uma fase de vapor. Para preparar os organoides para incorporação de parafina, substitua o meio por 500 microlitres de quatro graus Celsius PBS e transfira a suspensão de cada poço para tubos individuais de 1,5 mililitro contendo matriz de porão liquefeito.
Colete os organoides por centrifugação e use uma ponta de pipeta P1000 modificada para remover cuidadosamente os supernantes sem perturbar as pelotas. Em seguida, adicione um mililitro de gelo frio, 4% paraformaldeído aos organoides para uma incubação durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, substitua o fixador por um mililitro de PBS de temperatura ambiente para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente e lave os organoides por centrifugação três vezes.
Após a última lavagem, resuspenja os organoides em um mililitro de 30% de etanol para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, seguido por uma incubação de cinco minutos em um mililitro de 70% de etanol à temperatura ambiente. Ao final da incubação de 70% de etanol, recolham os organoides por centrifugação e resuspensem os organoides em um mililitro de 100% etanol por cinco minutos à temperatura ambiente. No final da incubação de 100% de etanol, o gel de processamento de amostras de calor em um micro-ondas por 20 segundos ou até liquefeito, e adiciona 50 microliters do gel liquefeito a cada tubo de organoides.
Coloque os tubos no gelo até que o gel de processamento da amostra seja solidificado e transfira a gota de organoides de cada tubo para entre as almofadas azuis de esponja em uma fita para processamento adicional no embedrador de parafina. Coloque o em um processador de tecido programado por 15 minutos por etapa e, em seguida, se sectionia os organoides incorporados à parafina em gel de processamento de amostras a quatro micrômetros por seção para coloração e análise imunohistoquímica de acordo com os protocolos padrão. A eficiência do revestimento organoide do ducto biliar extrahático é de aproximadamente 2% quando isolada de camundongos neonatais ou adultos.
Após a segunda passagem, a eficiência de revestimento de organoides extrahêgicos do ducto biliar derivados de camundongos adultos aumenta para 11% e permanece estável. A maioria dos organoides demonstra uma morfologia cística em todas as passagens com organoides irregulares raros. Os organoides atingem um pico de crescimento de cinco a sete dias, após os quais começam a acumular detritos intraluminais e se deterioram.
Portanto, para a manutenção da cultura organoide, os organoides devem ser divididos a cada sete a dez dias. Quando analisados com imunofluorescência, organoides extrahepáticos do ducto biliar consistem em uma população pura de células epiteliais marcadas por E-cadherina. As células organoides também demonstram marcadores de células progenitoras biliares, bem como marcadores de diferenciação biliar.
É importante ressaltar que uma alta porcentagem de células organoides possuem um cílio primário marcado por tubulina alfa acetilada, que é uma característica de cholangiocitos normais e sugere uma polarização celular organoide apropriada. É necessária uma adesão próxima à condição de temperatura descrita. Dissecção meticulosa do ducto biliar evita contaminação celular do pâncreas.
A perda de material celular pode ser evitada por manipulação cuidadosa após centrifugação. Esses organoides podem ser usados como modelos pré-clínicos, geneticamente e farmacologicamente manipulados, ou usados para testar drogas e os efeitos de agentes infecciosos. Este método pode ser usado por laboratórios que querem aproveitar modelos de camundongos geneticamente modificados para estudar melhor os mecanismos da biologia do cholangiocito.
