Este protocolo é significativo, pois não apenas demonstra abordagens para purificar vesículas da cultura em diferentes escalas, trocas, diferenças entre metodologias e também consideração por trabalhar com amostras de campo. A cianobactéria apresenta desafios únicos de amostragem e análise de vesículas. Essas técnicas têm isolado e concentrado com sucesso vesículas da cultura e de amostras ambientais.
Para concentrar amostras de menos de 500 mililitros, comece enxaguando os concentradores centrífugas de ultrafiltração de 15 a 20 mililitros com água ultrapurugal tipo 1. Carregue os concentradores na centrífuga e gire a 4.400 x g a quatro graus Celsius. Descarte a corrida e repita o passo pelo menos duas vezes.
Carregue a amostra de sobrenante em um concentrador enxaguado com água e gire sob as mesmas condições. Repita esta etapa até que a amostra esteja concentrada em um volume final de 15 a 30 mililitros. Para concentrar um volume de mais de 500 mililitros, realize a filtragem de fluxo tangencial, configurando o aparelho conforme descrito no manuscrito.
Conecte uma bomba peristáltica à linha de entrada e coloque grampos ajustáveis na linha de retentate. Higienize a filtragem de fluxo tangencial conforme descrito no manuscrito, em seguida, lave o dispositivo com um litro de água de grau ultrapure tipo 1. Adicione menos de 0,2 mícron no reservatório de amostras.
Aumente lentamente a velocidade da bomba e os níveis de pressão nas costas na linha retentate para aumentar a saída das linhas filtradas. Continue a executar a filtragem de fluxo tangencial e reabastecer o reservatório com a cultura supernante à medida que o material é removido. Pare de concentrar a amostra assim que o volume no reservatório atingir a menor quantidade possível para manter o fluxo na linha de admissão sem introduzir bolhas de ar.
Feche a linha de saída com um grampo. Remova a pressão traseira na linha de retentate. Recircular o supernanato concentrado através do filtro por 10 minutos, reduzindo a taxa de recirculação de 20 para 40 mililitros por minuto para maximizar a recuperação.
Mova a linha de retentate para um vaso limpo, remova a linha de admissão da amostra e colete o material concentrado. Recupere qualquer material restante no reservatório de amostras usando uma pipeta. Filtre o supernante concentrado através de um filtro de seringa de 0,2 mícingo.
Se necessário, armazene o concentrado final a quatro graus Celsius por aproximadamente três semanas antes de passar para a purificação vesícula. Para pelotar a amostra de cultura concentrada coloque-a em um tubo de ultracentrifuuagem limpo e adicione mídia limpa ou tampão para garantir que o tubo esteja cheio. Após a centrifugação, remova o sobrenatante com uma pipeta.
Redesenhe o material pelleted com mídia de cultura fresca ou tampão de lavagem, como salina tamponada com fosfato 1X e repita a centrifugação. Resuspend a última pelota em cultura fresca por pipetação suave com uma pipeta de um mililitro e transferi-la para um vaso limpo. Para realizar a ultracentrifugação de gradiente de densidade, prepare os estoques de iodixanol como descrito no manuscrito.
Misture uma parte do buffer 4X com três partes de estoque de 60% iodixanol para fazer uma solução de 45% de iodixanol. Diluir 45% iodixanol com buffer 1X para criar estoques de mídia gradiente de 40, 35, 30, 25, 20, 15 e 10% de concentrações iodixanol finais. Em seguida, sobreponha cuidadosamente quantidades iguais de todos esses estoques de gradiente iodixanol em um tubo ultracentrífuga, utilizando todo o volume do tubo.
Após a centrifugação, colete as frações de 0,5 mililitros cada para aproximadamente um gradiente de 4,5 mililitros, tubondo cuidadosamente ou usando um coletor de frações. Determine a densidade de cada fração, em gramas por mililitro, utilizando um equilíbrio analítico e pipeta calibrada. Retire a amostra do tubo, determine o peso e devolva a amostra ao tubo.
Diluir frações individuais com tampão limpo em um novo tubo seguido de uma mídia limpa ou lavagem de buffer. Aplique cuidadosamente cinco microliters de vesícula e deixe descansar por cinco minutos. Remova a amostra tocando a borda de uma grade em um pedaço de papel filtro limpo.
Pipeta de 20 a 50 microlitres de acetato de 2% de urânyl em uma superfície plana coberta por filme plástico. Em seguida, coloque a grade flutuando em cima dela por dois minutos. Remova o acetato deuranyl usando papel filtro e flutue brevemente em uma gota de água ultrauso para lavar.
Encha a câmara com água ultrauso usando uma seringa limpa e garanta que não haja bolhas de ar. Clique na câmera inicial e visualize a região ideal da câmara ao redor da impressão digital. Deslize os controles deslizantes do nível de captura e do nível da câmera para o máximo, em seguida, diminua para o nível mais baixo para ver as partículas mais fracas.
Ajuste o foco conforme necessário para garantir que as partículas sejam aproximadamente igualmente visíveis em todo o campo de visão e continue a lavar com água ultra limpa até que a câmara esteja limpa. Adicione a amostra de vesícula à câmara usando uma seringa de um mililitro e confirme as configurações de aquisição. Selecione a medição padrão da caixa de soltar SOP e altere as configurações para coletar pelo menos três réplicas técnicas de vídeos de 60 segundos cada.
Pressione criar e executar script' e siga as instruções e empurre aproximadamente 100 microliters de amostra para dentro da câmara entre as réplicas. Determine os parâmetros de partículas clicando em análise e experimento aberto e carregue o arquivo amostral. Selecione arquivos selecionados no processo e aguarde que a análise seja concluída.
O isolamento e caracterização de vesículas extracelulares do cianobacterium Synechocystis sp. PCC6803, mostrou que a membrana externa contém carotinóides, que conferem uma coloração laranja característica às amostras de vesícula coletadas por pelotização direta através da ultracentrifugação. A pelota vesícula resuspended foi examinada por microscopia eletrônica de transmissão, seja por manchas negativas de amostras com acetato de uranyl ou pela observação de seções ultrafinas.
A distribuição e concentração do tamanho da vesícula foram avaliadas por meio de análises dinâmicas de dispersão de luz e rastreamento de nanopartículas. As vesículas Synechocystis sp. PCC6803 foram separadas em um gel de sulfato-poliacrilamida de sódio e manchadas para lipopólise.
As amostras devem ser colhidas antes e depois da amostra concentrada de vesícula para garantir que a filtragem de fluxo tangencial esteja funcionando e as vesículas estejam se concentrando. Então você precisa medir ambas as amostras usando a análise de rastreamento de nanopartículas. Esforços futuros são necessários para fundir esse método com outras abordagens, como a cromatografia de exclusão de tamanho ou fracionamento assimétrico de fluxo de campo para melhorar a discriminação e o isolamento de pequenas partículas da cultura e amostras ambientais.
Esta técnica é útil para estudar as vesículas das cianobactérias e os papéis funcionais específicos dessas vesículas na biologia cianobacteriana.
