Este protocolo é importante porque fornece uma maneira de isolar vesículas extracelulares de uma variedade de bactérias de uma maneira altamente reprodutível. A grande coisa sobre esta técnica é que ela pode ser usada para isolar EVs de ambientes bastante grandes de culturas bacterianas, o que permitirá estudos in vivo. Embora os dados que mostramos reflitam aplicações pré-clínicas, é previsível que este protocolo possa ser adaptado para a fabricação de EVs bacterianos para terapia.
Este método pode ser aplicado a qualquer sistema de cultura de células escalável com pequenas modificações. Devido à escalabilidade do protocolo, é importante ter filtros de tamanho apropriado e colunas SEC para lidar com os volumes iniciais desejados de cultura de células bacterianas. Demonstrando os procedimentos estão Sadie Johnson, uma tecnóloga assistente no laboratório do Dr. Justin Lathia, Dionysius Watson, um bolsista de oncologia no laboratório do Dr. Justin Lathia, e Akeem Santos, um tecnólogo de pesquisa no meu laboratório.
Comece inoculando colônias únicas de Escherichia coli em 250 a 1000 mililitros de caldo de Luria-Bertani, ou LB, usando uma alça estéril. Em seguida, incube a cultura aerobicamente em uma incubadora de agitação a 300 rotações por minuto e 37 graus Celsius. Após 48 horas de incubação, esclareça o meio de cultura bacteriana transferindo as culturas celulares para limpar frascos de centrífuga de polipropileno de 500 mililitros para centrífuga em um rotor de ângulo fixo de grande capacidade a quatro graus Celsius e 5.000 vezes G por 15 minutos.
Transfira o sobrenadante para limpar os frascos de centrífuga despejando cuidadosamente a centrífuga a 10.000 vezes G por 15 minutos. Em seguida, transfira o sobrenadante para um dispositivo de filtro a vácuo de polietersulfona de 0,2 mícron de um tamanho apropriado e conecte o dispositivo de filtragem a uma fonte de parede a vácuo. Se a taxa de filtração cair significativamente, mova o material não filtrado para um novo dispositivo.
O meio filtrado pode ser armazenado a quatro graus Celsius durante a noite ou pode ser processado imediatamente. Para verificar a remoção completa das células viáveis, espalhe uma alíquota do sobrenadante filtrado em placas de ágar adequadas e assegure a ausência de colônias após a incubação em condições ótimas para a cepa bacteriana. Para concentrar o meio filtrado com um volume de 100 mililitros, carregar 90 mililitros de meio de cultura filtrado no reservatório do dispositivo de ultrafiltração centrífuga com um corte de peso molecular de 100 quilodaltons e centrifugar o meio no rotor da caçamba oscilante a quatro graus Celsius e 2.000 vezes G por intervalos de 15 a 30 minutos até que o volume do reservatório superior tenha sido concentrado a menos de 0,5 mililitros.
Para completar o reservatório com qualquer meio de cultura filtrado restante, remova o fluxo no fundo do dispositivo para reequilibrar. Se a viscosidade do meio concentrado no reservatório estiver visivelmente aumentada, diluir o meio com PBS e reconcentrar por centrifugação para reduzir qualquer vesícula não extracelular, ou proteínas EV, menores que o ponto de corte de peso molecular de 100 quilodaltons. Em seguida, transfira o meio concentrado para um tubo de ligação de baixa proteína para armazenar a quatro graus Celsius durante a noite Para concentrar o meio filtrado com um volume maior que 100 mililitros, selecione uma filtração de fluxo tangencial de tamanho apropriado, ou dispositivo TFF, com um corte de peso molecular de 100 kilodaltons.
Depois de montar um circuito de filtração, conforme explicado no manuscrito, bombeie 200 mililitros de PBS em um recipiente graduado para determinar a velocidade apropriada correspondente à taxa de fluxo desejada. Quando a velocidade estiver definida, faça circular o meio condicionado filtrado a aproximadamente 200 mililitros por minuto à temperatura ambiente e recolher as moléculas inferiores a 100 quilodaltons, atravessando a membrana de ultrafiltração como resíduo num recipiente separado até que o volume do meio condicionado tenha sido reduzido para 100 a 200 mililitros. Diluir sequencialmente o volume filtrado duas vezes com PBS e continuar circulando o meio com a bomba em recipientes menores para concentrar o volume em 75 a 100 mililitros e, em seguida, a 25 mililitros e 10 mililitros.
Levante a tubulação de alimentação para fora do reservatório da amostra e bombeie para purgar o filtro para recuperar a quantidade máxima da amostra. Mover a amostra concentrada para um dispositivo de ultrafiltração centrífuga de 15 mililitros com corte de peso molecular de 100 quilodaltons e centrífuga em um rotor de balde oscilante a quatro graus Celsius e 2.000 vezes G por intervalos de 15 a 30 minutos até que o volume do meio no reservatório superior seja inferior a dois mililitros. Transfira o meio concentrado para um tubo de ligação de baixa proteína para armazenar a quatro graus Celsius durante a noite.
Para o isolamento dos VEs, realize cromatografia de exclusão de tamanho, ou SEC, usando uma pequena coluna com um volume de leito de 10 mililitros para menos de 100 mililitros de material de partida e uma coluna maior com um volume de leito de 47 mililitros para mais de 100 mililitros de material de partida. Durante várias horas antes do experimento, traga a coluna SEC e a PBS à temperatura ambiente, seguidas pela estabilização da coluna em uma posição vertical usando um suporte e suporte de laboratório padrão. Antes de se conectar à coluna SEC, hidrate o reservatório da amostra permitindo que cinco mililitros de PBS fluam através da frita para um recipiente de resíduos.
Em seguida, desparafuse a tampa de entrada da coluna para adicionar dois mililitros de PBS ao reservatório da amostra e conecte cuidadosamente o reservatório à coluna à medida que o PBS estiver escorrendo pela frita. Para o equilíbrio da coluna, adicione 47 mililitros de PBS ao reservatório da amostra, seguido de destampar o fundo da coluna SEC. Em seguida, permita que todo o buffer de amostra carregado flua através da coluna e descarte o fluxo.
Depois de carregar dois mililitros da amostra no reservatório da amostra, permita que a amostra entre completamente na coluna e recolha o fluxo. Adicionar imediatamente PBS ao reservatório da amostra a um volume de 14,25 mililitros menos o volume da amostra para permitir que a solução flua através da coluna, descartando a quantidade igual ao volume vazio da coluna. Em seguida, posicione um microtubo de baixa ligação de dois mililitros diretamente abaixo da coluna SEC para coletar o primeiro fluxo ou fração um, depois de permitir que dois mililitros de PBS percorram a coluna.
Continue a adicionar dois mililitros de PBS ao reservatório da amostra para coletar cada fração subsequente. Armazene as frações coletadas a quatro graus Celsius para armazenamento de curto prazo ou menos 80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo. Para o teste de esterilidade das frações coletadas de EVs, inocular três mililitros do meio de cultura com 100 microlitros das frações a serem utilizadas nos ensaios.
Em seguida, cultive o meio em condições ideais enquanto observa a turbidez por pelo menos três dias. Alternativamente, as amostras de fração podem ser aplicadas a placas de ágar contendo o meio usado para cultivar as bactérias produtoras e, em seguida, verificar a formação de colônias. Em seguida, armazene os EVs transferindo 25 a 50% das frações individuais ou agrupadas para tubos de ligação de baixa proteína a menos 80 graus Celsius para evitar ciclos de congelamento-descongelamento.
A análise representativa mostra a eluição de Escherichia coli MP1 EVs nas frações iniciais de cromatografia. As frações de um a seis continham a maioria dos EVs, com diâmetro médio inferior a 100 nanômetros. Ao mesmo tempo, as frações subsequentes continham proteínas livres de EV e muito poucos EVs.
O enriquecimento e o tamanho do EV foram confirmados por microscopia eletrônica de transmissão, particularmente nas frações dois a seis. Observou-se que as frações enriquecidas com EV de dois a sete apresentaram alta atividade de nanoluciferase, mas apenas um sinal fluorescente muito baixo de mCherry não associado a EV em comparação com o das frações posteriores. A marcação imunoouro confirmou a associação EV da nanoluciferase nas frações dois a cinco.
A aplicabilidade do protocolo às demais espécies bacterianas foi avaliada por meio do isolamento de EVs das culturas de diversas bactérias anaeróbias. Observou-se que as primeiras frações de cromatografia de um a quatro foram enriquecidas para EVs, com diâmetro inferior a 100 nanômetros. A complexa infusão cérebro-coração, ou BHI, continha as partículas do tamanho de EV em menos de 25% do rendimento total de EV.
É importante utilizar dispositivos TFF capazes de manusear o volume inicial da cultura de células bacterianas. Esta técnica nos permite gerar EVs suficientes para fazer perguntas biológicas sobre sua função em modelos animais complexos.
