Este protocolo demonstrará a implementação e otimização da microscopia srs espectral e como ela pode ser usada para aplicações de histologia Raman estimuladas em tempo real. A principal vantagem desta técnica é a velocidade com que as amostras podem ser processadas uma vez que a instrumentação esteja adequadamente alinhada, já que o SRS não requer processamento e coloração de tecidos. Este protocolo é aplicável a outras aplicações srs, não apenas limitadas à histologia.
Tais aplicações incluem pequenas moléculas, drogas, células e tecidos. Comece instalando um par de lentes acráticas para o feixe de bomba para ampliar o tamanho do raio laser em duas vezes como ponto de partida. Coloque uma lente de 100 e 200 milímetros a cerca de 300 milímetros uma da outra.
Em seguida, alinhe o feixe da bomba através do centro de ambas as lentes. Em seguida, coloque um espelho após a segunda lente para enviar o feixe em direção a uma parede a mais de um metro de distância. Rastreie o feixe do espelho até a parede com um cartão IR e verifique se o feixe muda de tamanho.
Cobrem o feixe se o feixe mudar de tamanho em função da distância. Combine os dois raios laser instalando um espelho dicroico com vários espelhos de direção para ajuste. Otimize a sobreposição espacial da bomba e stokes monitorando feixes após o espelhodicróico em duas posições diferentes em torno de um metro de distância.
Ajuste iterativamente o espelho de direção seguido do espelhodicróico para alinhar o feixe de Stokes com o feixe da bomba. Certifique-se de que os feixes combinados sejam enviados para o centro dos espelhos de varredura do microscópio de varredura a laser, ajustando um par de espelhos de direção quando os espelhos de varredura estiverem na posição estacionada. Após o condensador, use outro par de lentes com distâncias focais de 100 milímetros e 30 milímetros, respectivamente, para retransmitir o feixe transmitido para o focdiodo, garantindo que ambos os feixes estejam contidos dentro do fotodiodo.
Em seguida, instale dois filtros de passagem baixa para bloquear o feixe de Stokes modulado. Coloque um sampler de feixe no caminho do feixe de Stokes para pegar 10% do feixe e enviá-lo para um fotodiodo rápido para detectar o trem de pulso de 80 mega-hertz. Pegue uma das saídas do buffer de fanout e filtre-o com um filtro de passe de banda para obter uma onda sinusoidal de 20 mega-hertz.
Em seguida, use um atenuador rf para ajustar o pico de saída para tensão máxima para aproximadamente 500 milvolts. Envie a saída resultante para um câmbio de fase, o que permite um ajuste fino da fase RF com uma fonte de tensão. Envie esta saída para um amplificador de energia RF e conecte a saída do amplificador ao EOM.
Depois de desbloquear o feixe de Stokes, otimize a profundidade de modulação do primeiro EOM colocando um fotodiodo no caminho do feixe. Ajuste a tensão EOM e a placa de onda de trimestre até que a profundidade de modulação pareça satisfatória. Coloque um fotodiodo após o espelhodicróico para detectar o raio laser.
Bloqueie o feixe de Stokes primeiro, depois amplie um dos picos de pulso da bomba no osciloscópio. Coloque um cursor vertical para marcar a posição temporal deste pico com o osciloscópio. Agora bloqueie o feixe da bomba e desbloqueie a viga de Stokes.
Traduza a etapa de atraso para corresponder temporariamente as posições de pico no osciloscópio à posição marcada na etapa anterior. Calculando a distância de atraso necessária para corresponder às duas vigas seguidas, alongando o caminho do feixe do feixe mais rápido ou encurtando o caminho do feixe do feixe mais lento. Em seguida, prepare uma amostra de slides de microscópio com DMSO e fita dupla face como um espaçador para segurar a amostra entre o slide e um deslizamento de tampa.
Coloque a amostra no microscópio com o lado do deslizamento de tampa voltado para o objetivo do microscópio e observe a amostra da peça I sob iluminação de campo brilhante. Encontre o foco da amostra tanto na camada superior quanto inferior das bolhas de ar na interface da fita de vidro e, em seguida, mova o foco para estar entre as duas camadas da fita. Em seguida, defina a saída do feixe tunable para 798 nanômetros.
Com base no rendimento óptico do condensador, ajuste a potência óptica para aproximadamente 40 miliwatts cada para a bomba e os feixes de Stokes no foco objetivo. Em seguida, abra a imagem de varredura no MATLAB e clique no botão de foco rotulado para iniciar a digitalização. Ajuste o espelho de direção antes que o scanner de galvo centralize o sinal DC no visor do canal um.
Mova o estágio de atraso motorizado e observe de perto a saída de bloqueio mostrada no visor do canal dois. Por fim, ajuste o atraso de tempo para maximizar a intensidade do sinal CA. Ajuste o espelho dicroico para centralizar o sinal SRS no canal CA.
Em seguida, ajuste a fase do amplificador de travamento para maximizar o sinal. Depois de montar a amostra deslize para o microscópio e ajustar a potência de ambos os feixes para aproximadamente 40 miliwatts cada um em foco de amostra, como demonstrado anteriormente. Abra a imagem de varredura do MATLAB.
Em seguida, encontre o sinal máximo srs através da fase de atraso correspondente ao pico de 2,913 centímetros inversos raman do DMSO. Adquira uma imagem SRS correspondente ao pico de 2,913 centímetros inversos de Raman do DMSO. Abra a imagem no ImageJ e selecione uma pequena área no centro do quadro.
Use a função de medida para calcular a média e o desvio padrão dos valores na área selecionada. Para calibração de acesso à frequência, salve uma varredura hiperespectral com a faixa de estágio de atraso cobrindo os picos de 2,913 e 2.994 centímetros inversos de Raman de DMSO. Em seguida, salve as posições de estágio correspondentes ao conjunto de dados hiperespectrais.
Realizar regressão linear para as posições de palco e Raman muda em 2,913 e 2.994 centímetros inversos. Usando a equação de regressão linear, converta as posições de atraso nas frequências raman correspondentes. Para calibração da resolução espectral, estime a posição do estágio com base na posição anterior com o aumento do comprimento óptico do caminho devido à inserção de hastes.
Realinhar a sobreposição espacial dos feixes devido ao leve desvio do feixe quando as hastes de vidro são adicionadas. Instale um divisor de feixe polarizador, uma placa de onda de quarto e um segundo EOM no caminho do feixe de imersão após o primeiro EOM. Desligue a entrada do sinal para o segundo EOM e, em seguida, conecte a entrada de sinal ao primeiro EOM e ligue-a.
Modular o feixe de Stokes em 20 mega-hertz enviando o feixe através do primeiro EOM. Ajuste a inclinação e a posição do primeiro EOM para garantir que o feixe esteja centrado através do cristal EOM. Prepare uma amostra de slides de tecido com fita dupla face, deslizamento de microscópio e vidro de cobertura.
Coloque a amostra no microscópio com o lado de deslizamento de cobertura voltado para o objetivo do microscópio. Para imagens SRS do modo epi, instale uma placa de meia onda antes que o feixe entre no microscópio para alterar a polarização do feixe que vai para o microscópio. Coloque um divisor de feixe polarizador acima do objetivo de permitir que o feixe refletido de costas despolarizada chegue ao detector.
Em seguida, use uma lente de acromato de 75 milímetros e uma lente asférica de 30 milímetros para retransmitir os fótons espalhados de trás da abertura traseira do objetivo para o detector de fotos. Monte o detector para coletar a luz dispersa traseira dirigida pelo divisor de feixe polarizador. Em seguida, instale um filtro para impedir que o feixe modulado entre no detector.
A variação dos comprimentos da haste afeta a resolução espectral. Quando não são usadas hastes de vidro, os dois picos raman da DMSO não são resolvidos. Um aumento no número de hastes de vidro começa a resolver os dois picos em um ponto satisfatório.
O chirping combinado resolve ambos os picos e pode ser usado para calibrar posições de estágio para frequência. Dois tempos de trem de pulso atrasado de polarização ortogonal usado para imagem espectros DMSO mostram o atraso de tempo entre as excitações srs com profundidade de modulação aceitável e separação temporal. Em contraste, uma mudança de fase de duas cores pobres, dá origem a picos invertidos ou negativos.
Em tempo real, duas imagens de SRS coloridas em 2,850 e 2.930 centímetros inversos de tecido cerebral ex vivo mouse são mostrados aqui. As imagens lipídicas e proteicas cruas foram codificadas por cores para produzir uma única imagem representando contribuições lipídicas e proteicas. Falsa hematoxilina e recoloração de eosina, também foram realizadas para imitar a hematoxilina e a coloração de eosina para aplicações patológicas.
A sobreposição temporal espacial e a otimização da resolução espacial são os passos mais importantes para a abordagem espacial focalização do SRS. Este método é geralmente aplicável para outros experimentos de microscopia de sonda de bomba, como microscopia de absorção transitória. O método também permite a imagem de moléculas não fluorescentes em células e tecidos.
O método aqui apresentado acelera o tempo de aquisição de imagens para futura tradução da histologia estimulada de Raman na clínica.
