Il saggio della cometa è ampiamente utilizzato per valutare la genotossicità. Il nostro protocollo offre una serie di vantaggi metodologici rispetto al saggio standard delle comete. La nostra tecnologia si concentra sul mantenimento verticale delle guide comete standard e sull'elaborazione in lotti di 25 in un rack appositamente realizzato.
Ciò include l'elettroforesi, quindi il serbatoio è più piccolo, utilizza meno buffer e ha un raffreddamento integrato. Essendo tenuti in un rack, i gel delicati sui vetrini sono più protetti e passano da una soluzione all'altra in 25 secondi. Utilizzando il nostro protocollo sulle comete di sangue, i ricercatori possono utilizzare una puntura di spillo di sangue per studiare i danni al DNA negli esseri umani, in altre specie e in un'ampia varietà di esposizioni ambientali potenzialmente genotossiche.
Tutti i diversi formati per il saggio della cometa che utilizzano vetrini da microscopio come supporto solido per i gel della cometa sono suscettibili al nostro approccio. La parte cruciale di questa tecnica è il caricamento dei campioni dopo la miscelazione con agarosio LMP. I campioni devono essere caricati rapidamente senza creare bolle e coperti con un vetrino di copertura immediatamente prima di solidificare.
Per iniziare, preparare lo 0,6% di agarosio a basso punto di fusione in PBS e metterlo a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Etichettare l'estremità smerigliata dei vetrini prepatinati con nome, data e informazioni sul trattamento utilizzando un pennarello o una matita indelebile. Posizionare una piastra di raffreddamento su una panca piana e inserire due pacchetti di raffreddamento congelati nel cassetto scorrevole sotto la superficie metallica.
Quindi, posizionare i vetrini sulla piastra di raffreddamento per pre-raffreddare per uno o due minuti. Centrifugare e rimuovere il surnatante dalle provette e rimetterle immediatamente sul ghiaccio. Risospendere il pellet cellulare con 200 microlitri di agarosio a basso punto di fusione allo 0,6% e miscelare mediante pipettaggio.
Quindi, aggiungere 80 microlitri di cellule contenenti agarosio su un vetrino refrigerato e posizionare rapidamente un vetrino di copertura sul gel. Lasciare riposare il gel sulla piastra di raffreddamento per uno o due minuti. Nel frattempo, preparare 500 millilitri di soluzione di lavoro di tampone di lisi e versarlo nel piatto di lisi.
Dopo che i gel si sono fissati, rimuovere rapidamente i vetrini di copertura tenendo delicatamente il vetrino tra pollice e indice e facendo scorrere la scivolata di copertura dal gel. Quindi, posizionare le diapositive all'interno di un portavetrini con tutti i segni di punti neri sulle diapositive rivolte nella stessa direzione. Posizionare il portavetrini all'interno del piatto di lisi.
Chiudere il coperchio della capsula di lisi e metterlo per l'incubazione. Rimuovere con attenzione il portavetrini dalla capsula di lisi senza disturbare i gel. Posizionare delicatamente il portascorri in una piastra di lavaggio precaricata con acqua bidistillata ghiacciata.
Assicurarsi che le diapositive siano completamente sommerse e lasciare la configurazione per 30 minuti. Posizionare un pacco di raffreddamento congelato sotto il serbatoio di elettroforesi per mantenere la temperatura ottimale del tampone. Quindi, aggiungere la soluzione di lavoro per elettroforesi ghiacciata al serbatoio e trasferire il supporto del vetrino in esso.
Orientare i vetrini in modo che i gel contenenti cellule puntino verso il catodo. Incubare i vetrini nella vasca di elettroforesi per 20 minuti per consentire al DNA di svolgersi. Quindi, accendere l'alimentatore per eseguire l'elettroforesi per 20 minuti a 1,19 volt per centimetro.
Al termine dell'elettroforesi, spegnere l'alimentazione e rimuovere il portascorrimento dal serbatoio dell'elettroforesi. Lasciare scolare il portavetrini su carta velina per 30 secondi. Quindi, posizionare il portascorrimento in un piatto contenente tampone di neutralizzazione e lasciarlo per 20 minuti.
Successivamente, metterlo in una piastra contenente acqua bidistillata ghiacciata e lasciarlo per 20 minuti. Dopo il lavaggio, rimuovere il portavetrini dall'acqua e lasciare asciugare i vetrini in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per un'ora. Per reidratare i vetrini, trasferire il portavetrini in una piastra contenente acqua bidistillata ghiacciata e lasciarlo per 30 minuti.
Quindi, posizionare il portavetrini in un piatto colorante contenente 2,5 microgrammi per millilitro di soluzione di ioduro di propidio. Chiudere il coperchio del piatto colorante e incubarlo per 20 minuti al buio a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, trasferire il portavetrini in un piatto separato e lavarlo con acqua bidistillata ghiacciata per 20 minuti.
Rimuovere il portavetrini dal piatto e asciugarlo completamente al buio, in un'incubatrice a 37 gradi Celsius o a temperatura ambiente. Dopo che i vetrini si sono asciugati completamente, conservarli in una scatola di diapositive al buio fino al momento dell'analisi delle immagini. I cheratinociti umani sono stati irradiati con diverse dosi di UVA e UVB o trattati con perossido di idrogeno a 50 micromolari per indurre danni al DNA.
La tensione ottimale era di 1,19 volt centimetrici, in quanto induce la risposta più sensibile e la più grande percentuale di DNA di coda. Il sangue intero umano è stato irradiato con diverse dosi di UVA e trattato con diverse concentrazioni di Fpg. Il saggio della cometa alcalina ad alto rendimento ha rivelato che i livelli ottimali di danno al DNA sono stati indotti con quattro unità per millilitri di Fpg.
La linea cellulare di cancro ovarico SK-OV-3 è stata trattata con una combinazione di cisplatino e perossido di idrogeno. Le cellule non esposte non hanno mostrato danni. L'esposizione al perossido di idrogeno da sola ha generato un significativo momento medio di coda di oliva rispetto alle cellule in cui sono stati indotti i legami incrociati intrafilamento del DNA.
Dopo il trattamento con cisplatino 100-micromolare, i legami incrociati intrafilamento del DNA sono aumentati con un picco a 12 ore, dopo di che i livelli sono diminuiti a zero dopo 30 ore È essenziale mettere l'impacco di ghiaccio nella vasca di elettroforesi e incubare i vetrini per 20 minuti per svolgere il DNA prima dell'elettroforesi. Questo passaggio aiuterà il DNA danneggiato a viaggiare per corrente. L'esecuzione del test con vetrini posizionati verticalmente ci ha permesso di automatizzare il saggio della cometa.
Inoltre, la nostra tecnica ha semplificato il saggio della cometa per la ricerca.
