A replicação viral do HBV no extraheptico desempenha um papel importante na patogênese das síndromes extrahepépticas. Atualmente, os modelos de cultura celular para iniciar a infecção por HBV extraháptica são limitados. Apresentamos um modelo de infecção in vitro não hepática para ajudar a identificar novos fatores hospedeiros que afetam a replicação do HBV e investigar doenças renais relacionadas ao HBV.
Em comparação com os modelos tradicionais de infecção por HBV, adotamos e projetamos a linha celular 293T, 293T-NE-3NR, e co-cultivado com HepG2.2.15. A infecção por HBV deve ser realizada em um laboratório de biossegurança nível dois ou biossegurança três. As práticas de segurança laboratorial devem ser seguidas para garantir a segurança do pessoal do laboratório e de todos os pesquisadores devem ser vacinados e detectar o anticorpo HBS positivo antes de realizar experimentos de HBV.
Comece por estar o HepG2.2.15 células tendo em mente que a supernasce celular, bem como todas as pontas, frascos, placas e tubos que entram em contato com HepG2.2.15 devem ser encharcados em 2% de virucida durante a noite antes do descarte. Remova o frasco contendo células HepG2.2.15 de nitrogênio líquido e descongele-o em um suave redemoinho em um banho de água de 37 graus Celsius. Transfira as células para um frasco de cultura de tecido quadrado de 25 centímetros e adicione quatro mililitros de meio de cultura completa.
Cultura as células HepG2.2.15 a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono em uma incubadora umidificada. Troque o meio a cada três dias. Quando estiver pronto, colete a célula sobrenana em um tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Feche a tampa com firmeza e enrole-a com filme de parafina. Para remover os fragmentos celulares, filtre o supernatante HepG2.2.15 com uma membrana de 0,45 micrômetros em um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, adicione 14 mililitros de supernaca filtrado a uma coluna concentradora de vírus e feche a tampa.
Centrifugar a coluna a 3.200 vezes g por 35 minutos em uma centrífuga giratória horizontal e coletar o concentrado de supernasal HepG2.2.15 em um tubo de 1,5 mililitro. Execute o PCR em tempo real para garantir que a concentração se o DNA HBV no concentrado supernacante HepG2.2.15 estiver dentro da faixa de curva padrão. Diluir o concentrado 20 vezes adicionando 10 microliters a 190 microliters de DMEM em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Juntamente com o concentrado supernante, prepare um controle negativo, controle positivo e quatro diluições da referência quantitativa. Adicione 450 microliters de tampão de extração de DNA HBV a cada amostra e centrífuga-os a 12.000 vezes g durante cinco minutos em temperatura ambiente. Combine 27 microliters de mix mestre PCR e três microliters de enzima de polimerase Taq por amostra em tubos PCR colocados no gelo.
Em seguida, adicione 20 microliters da amostra centrífuga em cada tubo. Realize o PCR em tempo real de acordo com as instruções do manuscrito e exporte os valores do CT para obter uma curva padrão. Divida o concentrado supernacante HepG2.2.15 em alíquotas e armazene-o a menos 80 graus Celsius até estar pronto para usar.
Prepare o meio de infecção de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, semente HepG2-NE em dois poços, 293T-NE-3NR células em dois poços, e 293T-NE em um bem. Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma incubadora umidificada por 24 horas.
Após a incubação, observe as células e proceda com a infecção se estiverem saudáveis. Adicione 500 microliters do complexo de infecção a cada poço e incuba as células por mais 24 horas. Lave as células duas vezes com 500 microliters de PBS.
Em seguida, adicione um mililitro de médio a cada poço. Troque o meio suavemente a cada dois dias. No dia 11, lave suavemente as células duas vezes com 500 microliters de PBS e fixe as células com metanol gelado para imunofluorescência.
Semente 100.000 células por poço de HepG-NE em dois poços, 293T-NE-3NRs em dois poços, e 293T-NE em um poço da placa. Sementes 100.000 células por poço de HepG2.2.15 em cinco inserções de membrana em uma placa separada de seis poços. Incubar as células por 24 horas.
Após a incubação, certifique-se de que as células são todas aderentes e em bom estado. Descarte o meio na placa de seis poços e nas pastilhas da membrana celular. Em seguida, coloque as pastilhas de membrana com HepG2.2.15 na placa de seis poços semeada com HepG-NE, 293T-NE-3NRs e 293T-NE.
Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma incubadora umidificada, mudando o meio a cada três ou quatro dias. Após 10 dias, remova as pastilhas de membrana, lave suavemente as células com PBS duas vezes e fixe as células com metanol gelado para imunofluorescência. A incubação com o anticorpo primário HBcAg e o DAPI resultou em uma coloração distinta quando observada com um objetivo de 10X em um microscópio invertido fluorescente.
A localização nuclear foi confirmada por coloração com expressão DAPI e NTCP-EGFP foi identificada com fluorescência verde. Os locais de expressão de HBcAg foram localizados com fluorescência vermelha. Quando DAPI, NTCP e HBcAg estão na mesma célula, a célula foi infectada com sucesso com HBV.
O grupo Ciclosporina A foi o controle negativo porque impede o HBV de entrar nas células bloqueando o NTCP. O HBcAg foi detectado em 293T-NE-3NRs, mas não em células 293T-NE indicando que o NTCP não é o único fator essencial para a infecção pelo HBV em 293T. Bom status celular e operação eficiente são os pontos-chave para obter resultados de infecção bem sucedidos.
Lavar suavemente e mudar a mídia após a infecção também é importante. Como alternativa, o método de infecção por HBV com células HepG2-NE baseadas em hepatoma tem maior eficiência de infecção do que este método e é adequado para a triagem de medicamentos anti-HBV. Modelar a infecção por HBV em 293T-NE-3NR é um elogio útil ao modelo celular tradicional devido ao fundo não hepático dessas células.
Este método facilitará o estudo da infecção por HBV em células não hepáticas, bem como fatores hospedeiros necessários para o fígado de HBV.
