O novo ensaio ECL 6-Plex é o primeiro ensaio multiplex validado e agora aplicado em ensaios clínicos para triagem da população em geral. Ele combina simultaneamente seis ensaios de autoanticorpos adequados para a triagem de diabetes tipo 1, doença celíaca e COVID-19 em uma grande população. Em comparação com o atual ensaio padrão de autoanticorpos, essa técnica pode rastrear de forma mais eficiente vários autoanticorpos para múltiplas doenças autoimunes simultaneamente.
A implicação dessa técnica tornará o rastreamento em larga escala mais viável e específico da doença, levando à predição precoce da doença para prevenção e diagnóstico mais preciso para a terapia. Para começar, adicione quatro microlitros de proteína de antígeno biotinilado GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 e proinsulina em um tubo contendo 156 microlitros de 1% de BSA e misture com 240 microlitros de ligantes conjugados com treptavidina correspondentes, 1, 2, 3, 8, 9 e 10. Em seguida, incubar a mistura por 30 minutos à temperatura ambiente.
Aliquot 160 microlitros de solução de parada em cada tubo e incubar a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos. Agora, pegue 400 microlitros da solução de mistura de cada tubo e combine-os. Adicione quatro microlitros de GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 e antígeno proinsulina marcados com rutênio à mistura.
Em seguida, adicione 1,6 mililitros de solução de parada e 3,2 mililitros de PBS. Misture bem todos os componentes. E agora, a solução de antígeno está pronta para uso no ensaio.
Para uma placa de PCR de 96 poços, alíquota de sete microlitros de soro por poço e cubra a placa com um filme de vedação. Em seguida, pré-aqueça os soros a 56 graus Celsius por 30 minutos em uma máquina de PCR e centrifugar brevemente a placa a 100 vezes G por um minuto. Adicione 63 microlitros de solução de antígeno preparada por poço, misture com os soros e cubra a placa de PCR com folha de vedação para evitar a luz.
Agite a placa num agitador a uma velocidade de 450 rpm durante duas horas à temperatura ambiente. E então, incube a placa a quatro graus Celsius por 18 a 24 horas. Pegue uma placa de 6 Plex da geladeira de quatro graus Celsius, permitindo que a placa atinja a temperatura ambiente.
Em seguida, adicione 150 microlitros de 3%Blocker A a cada poço da placa 6-Plex. Cubra a placa com papel alumínio para evitar a luz. Coloque a placa de volta em uma geladeira de quatro graus Celsius e incube durante a noite.
No final da incubação, uma vez que a placa é removida da geladeira, remova todo o tampão da placa. Coloque o prato nas toalhas de papel para secar e lave-o três vezes com 150 microlitros de tampão de lavagem por poço de cada vez. Seque a placa na toalha de papel e alíquota 30 microlitros de antígeno sérico incubar de cada poço da placa de PCR de incubação durante a noite em dois poços da placa de 6-Plex.
Cubra a placa com papel alumínio, depois coloque a placa num agitador de placas e agite com uma velocidade de 450 rpm à temperatura ambiente durante uma hora. Despeje a solução presente na placa 6-Plex e lave a placa três vezes com 150 microlitros de tampão de lavagem de cloreto de sódio 0,4 M por poço. Após a conclusão da terceira lavagem, seque o prato contra o papel toalha e adicione 150 microlitros de tampão de leitura em cada poço.
Os níveis de seis autoanticorpos para GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA e COVID-19A do ensaio de ECL 6-Plex foram bem correlacionados com seus seis ensaios de ECL únicos correspondentes e o ensaio padrão de ligação por rádio atual. Os valores do índice para cada amostra para todos os seis anticorpos foram calculados em relação aos controles positivos e negativos correspondentes. Observou-se um valor de índice maior que o valor de corte, o que indicou um resultado positivo.
Os autoanticorpos no soro romperam o antígeno marcado com rutênio para o antígeno biotinilado, formando um complexo com um ligador específico para construir uma plataforma de multiplexação. Essa tática torna o rastreamento em larga escala mais viável e mais eficiente na população em geral para diabetes tipo um e doenças concomitantes, levando à previsão precoce e prevenção das doenças.
