Este protocolo fornece informações sobre a progressão do modelo tumoral de forma não destrutiva. Também dá indicações de resposta terapêutica através de regimes medicamentosos inteiros dentro de agregados singulares, em vez de depender de amostras de correspondência etária. Métodos convencionais para obtenção de densidade celular e viabilidade dentro dos agregados requerem fixação e seção de amostras, enquanto os nossos fornecem dados não destrutivos.
Assim, as alterações podem ser rastreadas dentro de um único agregado ao longo do tempo. Espera-se que essa técnica melhore nossa compreensão da resposta a medicamentos em regiões discretas de modelos agregados, com implicações sobre o quão bem esses modelos refletem em respostas vivas e aplicações de triagem de medicamentos. Para começar, prepare culturas celulares de 70 a 90% de confluência das linhas celulares desejadas em condições padrão.
Monocamadas celulares separadas de seus frascos de cultura seguindo o método padrão de trypsinização e adicionam a suspensão celular em um tubo de centrífuga. Adicione 10 microliters da suspensão celular a um hemótmetro e conte via microscopia para determinar o número de células na suspensão. Células de pelotas através de centrifugação e células resuspendidas na mídia na concentração desejada de 2,5 vezes 10 para as quintas células por mililitro.
Para suspensões preparadas com a matriz de membrana do porão, remova o frasco de matriz de menos 20 graus Celsius de armazenamento e colocado na geladeira para descongelar durante a noite. Prepare um recipiente com mídia de crescimento e leve à geladeira por 10 minutos para esfriar. Usando uma ponta de pipeta congelada adicione a matriz à mídia refrigerada de modo que a concentração final desta solução seja 5%Adicione 50 microliters desta mídia a cada poço de um fundo redondo, placa de 96 poços não aderentes, de modo que a concentração final de matriz nesses poços será de 2,5% após a adição de suspensão celular.
Para suspensões preparadas sem matriz, adicione 50 microliters de mídia de crescimento simples a cada poço. Distribua 50 microliters de suspensão celular em cada poço. Centrifugar as placas a 123 G por 10 minutos à temperatura ambiente imediatamente após a semeadura para garantir a coleta de uma pelota de célula na parte inferior de cada poço.
Utilize um sistema OCT para imagens estruturais. Defina a taxa de varredura A para 5,5 kilohertz para coleta de imagens de alta resolução. Defina o índice de refração para 1,33 para amostras em meio líquido.
Na janela de parâmetros de imagem no lado direito da tela, defina o campo de visão inserindo valores X, Y e Z de tal forma que a amostra esteja englobada dentro desta região de interesse. Clique no Modo de Aquisição 3D e clique em Gravar para coletar a varredura de volume 3D da amostra. Para criar reconstrução de volume, abra Imaris e navegue até o arquivo TIF convertido dentro de sua arena.
Vá editar e, em seguida, clique em Propriedades de Imagem e insira o tamanho do voxel da imagem OCT nas caixas XYZ correspondentes. Em seguida, clique em OK. Clique em Adicionar novas superfícies acima da árvore de objetos. No menu abaixo da árvore, clique em Pular criação automática e editar manualmente.
Dentro da janela de ajuste do display, deslize manualmente as setas vermelha e preta para melhorar o contraste entre a amostra e o fundo e melhorar a visualização da amostra. Ajuste a posição da fatia na fatia em uma borda da amostra. Use a tecla escape para alterar o mouse do modo de navegação para o modo seleto e, em seguida, clique em Desenhar.
Rastreie manualmente o contorno da região exibindo o sinal. Avance a posição da fatia digitando a próxima posição na caixa de entrada. Esta próxima posição deve ser inferior ou igual a 100 fatias mais para a amostra do que a anterior.
Rastreie manualmente a região exibindo o sinal. Repita este passo através da espessura da amostra até que a borda oposta da amostra seja atingida. Em seguida, clique em Criar superfície e menu esquerdo para costurar essas fatias juntos.
Por fim, clique em Editar e clique em Seleção de máscaras e clique em OK para concluir a reconstrução do volume. Para obter a densidade total da célula da amostra, selecione Adicionar novos pontos. No menu de configurações do algoritmo, desmarque todas as caixas.
Clique na seta azul para mover-se para a tela do canal de origem. No menu suspenso que aparece, selecione o Canal Mascarado. Insira o diâmetro médio da célula para a amostra na caixa de diâmetro XY.
Certifique-se de que a subtração de fundo seja verificada. Clique na seta azul para mover-se para a tela do ponto de classificação. No gráfico na parte inferior do menu, clique e arraste a borda esquerda do limiar amarelo para a borda esquerda do gráfico, de modo que todos os objetos estejam incluídos no limiar amarelo sombreado.
Em seguida, clique no arqueiro verde para completar a criação do local. Obtenha o número de objetos identificados clicando em Estatísticas. Em seguida, clique em Geral e, finalmente, clique em Número Total de Pontos.
Clique na superfície criada e navegue até a guia de qualidade de estilo de superfícies. Altere a seleção para Center Point e altere a largura do pixel para menos de 20 para melhor visibilidade. Navegue até estatísticas.
Em seguida, clique em Detalhado, seguido de Posição e regise a localização no ponto central. Selecione Adicionar novo quadro de referência no menu acima da árvore de objeto. Verifique as caixas visíveis e fixas ao lado do X, Y no menu.
Clique e arraste o centro do ícone do quadro de referência de tal forma que ele esteja alinhado com o ponto central. Desmarque as caixas de correção e xy e selecione-as para XZ. Mais uma vez, clique e arraste o centro do ícone do quadro de referência de tal forma que ele esteja em linha com o ponto central. Por fim, repita isso para o plano YZ, alternando entre esses três planos fixos até que o quadro de referência se alinhe perfeitamente com o ponto central.
Clique duas vezes no quadro de referência na árvore do objeto e renomeie-o central ou semelhante. Clique nos pontos criados e navegue até Estatísticas. Em seguida, clique em Detalhado, seguido de Quadro de Referência de Posição.
Clique no quadro de referência da posição X até classificar de maior para menor valor. Registre o maior valor para obter o raio agregado. Realize cálculos manuais para determinar locais adicionais de interesse.
Para isso, adicione 100 micrômetros ao valor do centro X e, em seguida, use os valores Y e Z do ponto central para definir a primeira localização ao longo do eixo central. Selecione Adicionar novos pontos. Em seguida, selecione Pular a criação automática editar manualmente.
Segure o botão de mudança no teclado e clique em qualquer lugar da tela para colocar um novo ponto. Insira os valores de posição XYZ para a primeira localização de interesse. Em seguida, selecione Adicionar novo quadro de referência e alinhá-lo sobre o local.
Adicione 100 micrômetros a cada local X sequencial. Coloque o último quadro de referência inferior a 50 micrômetros de distância do raio externo da amostra. Clique nos pontos criados e navegue até Estatísticas.
No canto inferior direito do menu, clique em Exportar todas as estatísticas para arquivar e salvar dados em uma planilha. Abra a planilha. Navegue até a distância da guia de quadro de referência de origem.
Use a função mod para atribuir numericamente cada distância ao seu quadro de referência correspondente. Filtre os valores nesta coluna para trabalhar com as distâncias em cada quadro de referência. Para cada um dos quadros de referência, calcule o número de objetos dentro de 50 micrômetros do quadro usando a função COUNTIF.
O valor resultante corresponde ao número de células naquele plugue regional. Divida esse valor pelo volume do plugue de 100 micrômetros para obter densidade celular. O teste T do aluno revelou uma densidade celular significativamente maior no núcleo esferoide do que nas camadas transitórias e externas para modelos esferoides MDA-MB-231.
O resultado indica compactação neste núcleo esferoide após quatro dias. Dentro dos modelos agregados AU565 e MDA-MB-231, a adição da matriz não parece afetar o volume ou a contagem de células, e, portanto, parece ter influência insignificante na proliferação celular. Em vez disso, a adição matricial parece redistribuir a densidade celular promovendo uma compactação significativa do núcleo e diminuindo a densidade celular nas camadas externas.
Esses achados fornecem uma visão valiosa dos mecanismos físicos pelos quais a matriz permite a agregação celular em diferentes linhas celulares de câncer de mama. Olhando em seguida para os tumores de 565 esferoides preparados com matriz, os agregados amadurecidos foram tratados com trastuzumabe e a densidade celular regional foi avaliada através de um regime medicamentoso de cinco dias. Os plugues foram definidos a cada 100 micrômetros ao longo da espessura dos agregados.
Pequenas flutuações na densidade celular foram observadas ao longo do tempo dentro dos 500 micrômetros internos de cada agregado indicando morte celular mínima. A visualização da morte celular como resposta indicativa de drogas principalmente nas camadas externas de esferoides tumorais é consistente com problemas de penetração de drogas de trastuzumabe. Agora podemos medir a viabilidade celular não destrutiva em agregados sem sacrificar a estrutura.
Isso permite a avaliação da resposta longitudinal de medicamentos em agregados tumorais singulares para identificar qualidades temporais e de penetração de medicamentos anticâncgenos candidatos.
