Este protocolo foi desenvolvido para fornecer um método robusto para a medição da beta-oxidação total mitocondrial e peroxisomal do ácido graxo em hepatócitos primários do camundongo. O uso de células intactas mantém a integridade da organela e os mecanismos regulatórios em vigor. Além disso, o ensaio de hepatócitos recém-isolados minimiza mudanças na expressão genética em relação ao fígado de origem.
A cirurgia pode ser desafiadora. Você tem que ser confiante, diligente e focado. Uma vez que a cannulação seja bem sucedida, tente relaxar, mas preste atenção e monitore a qualidade da perfusão.
Para iniciar o procedimento, pulverize liberalmente o abdômen e o peito do rato anestesiado com 70% de etanol. Em seguida, use os fórceps para puxar a pele e a parede abdominal perto da base do abdômen e cortar lateralmente em ambos os lados da linha média e até o diafragma para expor os órgãos. Exponha a veia cava inferior, ou IVC, movendo os intestinos para o lado direito e gentilmente virando os lóbulos do fígado para cima.
Insira um pequeno objeto cilíndrico, como uma tampa de agulha, sob a parte de trás do mouse para inclinar ligeiramente o IVC e facilitar a cannulação. Depois de ligar a bomba com tampão na velocidade mais baixa, insira a agulha no IVC. Em seguida, corte a veia portal para aliviar a pressão e permitir a drenagem de tampões sanguíneos e de perfusão.
Antes de aumentar a vazão para sete mL por minuto. Perfunda o fígado com tampão quente e certifique-se de que a linha inserida no tubo contendo tampão permanece continuamente submersa para evitar a introdução de bolhas de ar. Enquanto a perfusão ocorre, adicione 130 microliters de solução de colagenase ao buffer dois, e misture por pipetação com uma pipeta sorológica.
À medida que o volume no tubo contendo tampão diminui para cerca de cinco mL, adicione lentamente cinco mL de tampão dois para tampão um por tubulação na lateral do tubo. Repita a adição duas vezes antes de adicionar o buffer restante dois ao tubo. Pare a perfusão quando cerca de 5 a 10 mL de tampão dois são deixados no tubo.
Em seguida, extire o fígado e transfira-o para o prato de cultura de 100 mL contendo 20 mL de tampão gelado dois. Sob a coifa de fluxo laminar, quebre suavemente o tecido do fígado usando tesouras cirúrgicas e pinças. Em seguida, adicione cerca de 20 mL de tampão M199 gelado à suspensão dos hepatócitos e filtre-o através de um coador de células de 100 mn usando o êmbolo de uma seringa para promover suavemente a liberação de hepatócitos adicionais das peças de fígado maiores.
Lave o prato de cultura de 100 mL e o coador de células com tampão M199 para coletar a suspensão celular até que o tubo de coleta esteja cheio. Em seguida, centrifufique a suspensão a 50 x g por dois minutos a quatro graus Celsius. Aspire o supernaente antes de reutilizar a pelota de hepatocitte em 30 mL de M199 frio girando.
Repita a lavagem uma vez. Descongele o ácido palmítico e a albumina de soro bovino, ou BSA, soluções antes de preparar a mistura de substrato para múltiplas reações. Alíquota 13,5 microliters de solução BSA por reação em um tubo de microcentrifuuagem.
Depois de aquecer o tubo a 41 graus Celsius, adicione um microliter da solução de ácido palmítico de 200 mM por reação. Vórtice o tubo vigorosamente antes e durante a incubação a 41 graus Celsius por 20 a 30 minutos para facilitar a formação do complexo palmítico solúvel ácido-BSA. Durante este tempo, alíquota de 133 microlitadores de 1 M de ácido polemóico que será usado para parar as reações em tubos separados de microcentrifuuge de 1,5 mL.
Antes de iniciar as reações, aliquot e incubar 485,5 microliters de tampão M199 por reação em um tubo a 37 graus Celsius para diluir o complexo de ácido bsa-palmítico radioativo preparado. Em seguida, dispense 750 microliters de M199 com ou sem inibidores nos tubos de fundo redondos separados de 14 mL como as amostras. Durante as etapas de lavagem de hepatócitos, 10 a 15 minutos antes de iniciar as reações, transfira os tubos para um banho de água tremendo definido para 37 graus Celsius a 180 a 200 rotações por minuto.
Se a viabilidade dos hepatócitos estiver pelo menos 75% completa a preparação da mistura de substrato transferindo 0,8 microliters de ácido palmítico carbono-14 por reação ao tubo de microcentrifuuge contendo a solução de ácido BSA-palmítico clarificado. Vórtice antes de devolver o tubo ao banho de água a 41 graus Celsius. Imediatamente após a ressuspensão hepatocitada final, transfira 750 microlitres da suspensão de hepatócito para cada um dos tubos de fundo redondos de 14 mL no banho de água tremendo usando uma pipeta de um mL e vórtice os tubos brevemente em baixa velocidade antes de transferir para uma incubadora, cambaleando cada adição em 30 segundos.
Transfira uma alíquota separada de hepatócitos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para girar a 3000 x g por cinco minutos. Remova o supernasce antes de armazenar a pelota a menos 80 graus Celsius para medir a quantidade total de proteína na amostra para normalizar os resultados. Enquanto os hepatócitos estão sob pré-incubação a 37 graus Celsius, adicione o complexo radioativo de ácido BSA-palmitítico ao meio quente para manter a 37 graus Celsius até estar pronto para iniciar as reações.
Para iniciar as reações, remova os hepatócitos do banho de água e adicione 500 microliters da mistura de substrato aos hepatócitos. Vórtice as células em baixa velocidade por cinco segundos antes de retornar ao banho de água para incubar por 15 minutos. Inicie um conjunto de reações e pare imediatamente para determinar a radioatividade de fundo.
Transfira e reserve as alíquotas duplicadas de 200 a 250 microliters da mistura de substrato restantes em frascos de cintilação de 6 mL para realizar a contagem. Para parar as reações, remova os hepatócitos do banho de água para resuspensar com vórtice a uma velocidade moderada e, em seguida, transferir 400 microliters da suspensão hepatócito para os tubos de microcentrífuga contendo ácido polemizatório. Tampa imediatamente e vórtice os tubos antes de repetir a sequência para todas as amostras, cambaleando por 30 segundos.
Depois de girar os tubos de microcentrídulo de 1,5 mL a 13.000 x g por 10 minutos, transfira 300 microliters do sobrenante para um frasco de cintilação de 6 mL e adicione 4 mL do fluido de cintilação para contar a radioatividade nas amostras e o substrato mistura alíquotas em um contador de cintilação. No estudo, a perfusão hepática rendeu de 30 a 40 milhões de células por fígado, com viabilidade média de 80%, observou-se também que a redução da concentração de glicose no grupo de jejum não teve efeito negativo sobre o rendimento ou viabilidade dos hepócitos. A suspensão hepatocita, isolada de camundongos machos alimentados e em jejum, foi avaliada para a capacidade de beta-oxidação do ácido graxo na presença e ausência de etomoxir, um potente inibidor de CPT1 e oxidação de ácido graxo mitocondrial.
As contagens por minuto, ou CPM, associadas à radioatividade de fundo variam com o lote de ácido palmítico. No entanto, o CPM ainda foi significativamente menor do que as amostras incubadas com a mistura de substrato. Os hepatócitos isolados dos camundongos em jejum mostram um aumento robusto nas taxas de beta-oxidação de ácido graxo mitocondrial e peroxisomal.
Os dados foram estudados para determinar a taxa em que o ácido palmítico é oxidado nos hepatócitos isolados dos camundongos alimentados e em jejum. Evite que bolhas entrem na linha. Mantenha a agulha firme durante a perfusão.
Seja gentil ao lidar com os hepatócitos. Mantenha-os em suspensão ao dispensá-los. Os hepatocitos isolados deste procedimento podem ser usados como suspensão para avaliar outras vias metabólicas, como a síntese de ácidos graxos, ou podem ser banhados para experimentos de cultura celular.
