The authors gratefully acknowledge the National Science Foundation (NSF) for financial support of this work through a CAREER award (CBET-0746210) and through award CBET-1159500. We would like to thank Dr. Turkson (Univ. of Hawaii Cancer Center) and Dr. Altomare (Univ. of Central Florida College of Medicine) for assistance with cell culture.

1. Cultivar Linhas Celulares <ol><li> Thaw TE 71 (células epiteliais do timo mouse), MDA-MB-231 (células de câncer de mama humano), A549 (células de câncer de pulmão humano) e OVCAR3 (células de tumor do ovário humano) segurando os frascos criogênica em água morna por menos de 2 min . Adicionar 10 ml de meio DMEM suplementado com FBS a 10% para cada linha celular e centrifuga-se durante 6 min a 106 x g. </li><li> Aspirar a suspensão de 3 ml e adicionar meios para o sedimento. Misturar as células por pipetagem adequadamente várias vezes. Adicionar esta solução de células de pré-aquecida até 7 ml de meio DMEM suplementado com 10% de FBS em frascos T75 e manter os frascos em atmosfera humidificada de 95% ar / 5% de CO2 a 37 ° C. Marque esse balão como Passage 0. </li><li> Quando a confluência das células atinge 80%, a colheita das células, incubando-as com tripsina a 0,05% durante 10 min. Neutralizar a tripsina por adição de igual quantidade de mídia. Centrifugar esta solução durante 6 min a 106 x g. Retirar a suspensão e adicionar 3 ml de meio fresco a ele. Misture bem assimL e transferir pequena quantidade (100 ul) para um frasco de cultura contendo 7 ml de meio. Incubar o balão de cultura na incubadora. Rotular o frasco como uma passagem. </li><li> Cultura das linhas celulares até passagem 11 ou 12. </li></ol> 2. Fabrico de nanopartículas <ol><li> Preparação de ~ não diluído solução estoque 10 -6 M (ajustada) MEH-PPV <ol><li> Num frasco de 1 mg adicionar poli [2-metoxi-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-fenilenovinileno] (MEH-PPV) com um peso molecular (médio Mn) 150,000-250,000 g / mol e 3 ml de tetra-hidrofurano (THF) . Agita-se a mistura durante 2 h enquanto se aquecia a 80 ° C sobre uma placa quente. </li><li> Filtra-se a solução acima em um novo frasco utilizando um filtro de seringa de 0,2 um. Rotular esta solução como &quot;solução não diluída estoque MEH-PPV &#39;. Esta solução estará envolvido na preparação de nanopartículas depois de sintonia fina da concentração, tal como descrito nos passos 2.1.3 e 2.1.4. </li><li> Adicionar 50 ul de solução de reserva não diluída do MEH-PPV em 3 ml de THF. Rotular esta solução como &quot;solução diluída estoque MEH-PPV &#39;. Transferir para uma cuvete de quartzo de 1 cm e medir a absorvância a 495 nm por espectroscopia de UV-vis. </li><li> Se a absorvância da solução diluída MEH-PPV é maior do que 0,17, diluir a solução de reserva não diluída MEH-PPV pela adição de mais 1 ml de THF de cada vez, e repetir a etapa 2.1.3, até a absorvância medida a 495 nm ser no variam 0,13-0,17. </li><li> Calcula-se a molaridade da solução de estoque diluída MEH-PPV usando a Lei de Lambert-Beer, como mostrado abaixo. Aqui 0,15 absorvância é utilizado como um exemplo para o resto do protocolo (isto é., Ajustar todos os seguintes cálculos com base na absorvância observada), o coeficiente de extinção MEH-PPV utilizada é de 10 7 M -1 cm -1 e o comprimento do percurso é utilizada 1 cm. A = ε xbxc (Eq 1) (ε - o coeficiente de extinção molar, A - absorvância, b - comprimento do percurso, C - concentração da solução) 0.15 = 10 7 M -1 cm -1 x 1 cm XC (Eq 2) C = 1,5 x 10 @ 8 M (Eq 3) Utilizar esta concentração para encontrar a concentração da solução de reserva não diluída MEH-PPV como se segue: H 1 V 1 2 V = H 2 (Eq 4) 0,15 x 10 -7 M x 3050 ul = H 2 x 50 uL (Eq 5) 2 H = 9,15 x 10 -7 M (Eq 6) Esta é a concentração da &quot;solução de reserva não diluída, ajustada MEH-PPV &#39;. </li></ol></li><li> Cálculo de massa de MEH-PPV na solução não diluída ajustada estoque MEH-PPV <ol><li> Calcula-se a massa de MEH-PPV em 1 ml da solução não diluída estoque adaptados tal como indicado abaixo utilizando a molaridade obtido na secção 2.1.4 e o peso molecular (M w) de MEH-PPV, que é de 10 6 g / mol. M = n / V (n -. Não de moles, V - volume, em L) (Eqn 7) Assim, a massa de MEH-PPV em 1 ml de ajustado undsolução estoque iluted é 9,15 x 10 -4 g. </li></ol></li><li> Misturando PCBM em MEH-PPV <ol><li> Calcula-se a massa de C-Fenil 61 -butírico éster metílico do ácido (PCBM) para ser adicionado à solução de estoque MEH-PPV para fazer dopado solução MEH-PPV 50% em peso PCBM, em que 50% em peso PCBM é definido com respeito à massa de MEH-PPV (ou seja, metade da massa de MEH-PPV). Ao usar o peso de MEH-PPV obtidos na seção 2.2. Massa de PCBM / 9,15 x 10 -4 g de MEH-PPV x 100% = 50% em peso PCBM (Eq 8) Massa de PCBM = 4,57 x 10 -4 g (Eqn 9) </li><li> Pesar 1 mg PCBM num frasco e adicionar 500 mL de THF. Calcular a concentração de PCBM nesta solução com o peso molecular de 910,88 PCBM como g / mol A molaridade da solução PCBM = 0,001 g / (910,88 g / mol * 500 ul) (Equação 10) A molaridade da solução PCBM = 2,19 x 10 -9 mol / l (11 Eq) </li><li> Calcular o volume de solução necessário para PCBM adicionar ao não-diluido ajustado MESolução da H-PPV obter o PCBM dopado solução MEH-PPV 50% em peso em THF, utilizando a molaridade calculado no passo 2.3.2 4,57 x 10 -4 g de PCBM x 1 mol / 910,88 GX 1 ul / 2,19 x 10 -9 mol = 229 ul (Equação 12) Adicionar 229 ul da solução PCBM em 1 ml de solução de estoque MEH-PPV não diluído ajustado e misturar bem. </li></ol></li><li> Preparação de nanopartículas pelo método reprecipitação <ol><li> Transferir 1 ml da solução de MEH-PPV / PCBM misturados na seringa de 1 ml com a agulha ligada a ela. </li><li> Rapidamente injectar 1 ml da solução de MEH-PPV / PCBM misturado em 4 ml de água Dl agitação a 1200 rpm. Pare agitação imediatamente após a injecção. Use essas nanopartículas sem transformação. </li></ol></li></ol> 3. Incubação de linhas celulares com nanopartículas for Imaging Nota: Todos os experimentos com imagens foram concluídas em placas de Petri de 35 mm <ol><li> A absorção de nanopartiCiclos em linhas celulares <ol><li> Linhas celulares de cultura até a 12ª passagem. Nos 12 células de cultura de passagem th em 35 mm placas de Petri. Ajustar a concentração de células adicionadas às placas de Petri de 35 mm de tal forma que após 24 horas as células estão 40% confluentes. </li><li> Nesta fase, os meios de comunicação remover DMEM suplementado com FBS a 10% a partir das placas de Petri, lavar as células duas vezes com 1x de DPBS, e adicionar 100 uL da suspensão de nanopartículas em 2 ml de DMEM para as placas de Petri. </li><li> Após 24 horas remover o DMEM / suspensão de nanopartículas as placas de Petri e lavar as células com DPBS 1x 3 vezes. Em seguida, fixar as células por incubação com 4% de paraformaldeído durante 10 min. Lavar duas vezes com DPBS. Corar as células com 300 nM de DAPI por incubação com o corante durante 2 min. Lavar duas vezes com DPBS. Em seguida, manter as células em DPBS para a imagem latente. </li></ol></li><li> Detecção de ROS <ol><li> A549 Cultura e linhas celulares OVCAR3 em placas de Petri, 6 por linha de células, como explicado no ponto 3.1.1. Rotular oAs placas de Petri, como mostrado na Tabela 1. </li><li> Adicionar 100 ul da suspensão de nanopartículas em 2 ml de DMEM para três das placas de Petri, como mostrado na Tabela 1 e incuba-se durante 24 h. Para as placas de Petri que receberão doses de luz, lavar as células após 24 h e suspender as células em HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hank) Dye meios livres. </li><li> Aqueça-se a lâmpada do simulador solar para 15 min. Coloque filtro UV em frente da lâmpada para filtrar a luz ultravioleta. Calibrar a lâmpada com uma célula solar de referência através do ajuste da potência da lâmpada para se obter 0,5 sol (50 mW / cm 2) intensidade na superfície da placa de Petri. Nesta configuração particular que a condição foi alcançada com 218 W de potência fornecida à lâmpada. </li><li> Colocar as placas de petri sob a lâmpada (tampa aberta) durante 60 min, o que resulta em uma dose de luz de 180 J / cm 2, tal como mostrado nos cálculos abaixo: 50 mW / cm 2 seg x 3.600 / 1.000 = 180 J / cm 2 </li><li> Remover HBSS sem lavagem e adicionar mais 2 ml de meio DMEM suplementado com FBS a 10% para as placas de Petri. Incubam-se as células durante mais 2 h. </li><li> Para o controlo positivo incubar as células com 100 | iM de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) durante 30 min. </li><li> Corar as células em todas as placas de petri com uma concentração final de 5 uM de o reagente de detecção de ROS por incubação das células com o corante durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Fixar as células por incubação com 4% de paraformaldeído durante 10 min. Lavar duas vezes com DPBS. Corar as células com 300 nM de DAPI por incubação com o corante durante 2 min. Lavar duas vezes com DPBS. Em seguida, manter as células em DPBS para a imagem latente. </li></ol></li><li> Apoptose e necrose por PI e anexina V FITC <ol><li> Cultura em cada linha de células 5 placas de Petri. Três destes pratos de Petri será para a experiência, enquanto os restantes 2 placas de petri será amostras de controlo. Incubar as 3 placas de Petri para experimento com nanopartículas como explained no ponto 3.1.2. As amostras de controlo não são incubadas com nanopartículas. </li><li> Após 24 horas de incubação seguir o passo 3.2.3. </li><li> Colocar as placas de petri de 3 experimentais sob a lâmpada (tampa aberta) e remover um em 20 minutos, uma de 40 min e um aos 60 min. Obteve-se três amostras que foram expostas a doses de luz de 60, 120 e 180 J / cm2, respectivamente (de cálculo na secção 3.2.4). Em seguida, administrar uma de 180 J / cm 2 de dosagem de luz a um dos pratos de Petri de controlo. Este é o controlo com dose de luz aplicada na ausência de nanopartículas. Não aplicar dose de luz para a amostra de controlo restantes (sem nanopartículas e nenhuma dose de luz aplicada). </li><li> Substituir o HBSS com meio DMEM suplementado com 10% de FBS e manter as placas de Petri em incubação durante 4 horas. </li><li> Corar as células do experimental e as placas de Petri de controlo com 20 uL de FITC anexina V por incubação das células com o corante durante 15 min. Lavar duas vezes com DPBS. Manchar o cells com 300 nM de DAPI, bem como 300 nM de PI (iodeto de propidio), por incubação com os corantes por 2 min. Lavar duas vezes com DPBS. Em seguida, manter as células em DPBS para a imagem latente. </li></ol></li></ol> 4. Nanopartículas de citotoxicidade intrínseca <ol><li> Contar as células e cultura em placas de 96 poços <ol><li> Colheita das células a partir de balões de cultura, removendo meios e lavagem das células duas vezes com DPBS, seguido de incubação das células com tripsina a 0,05% durante 10 min. Adicionar 2 ml de meio DMEM suplementado com FBS a 10% para a solução de células resultante. Misture a solução correctamente para separar agregados de células em singuletos. </li><li> Tome 100 ul da suspensão de células e 900 ul adicionar ao meio DMEM suplementado com FBS a 10%. Misture bem. Colocam-se 10 uL desta suspensão para um hemocitómetro. Contar as células utilizando um hemocitómetro e a ajustar a concentração da suspensão de células em 4.1.1 a 5 x 10 4 células / ml. </li><li> Take 5 placas de 96 poços rotulado como 0 h, 24 hr, 48 h, 72 he 96 h. Adicionar 50 ul de 5 x 10 4 culas / ml (soluções de células TE 71 e A549) nas cavidades, como se mostra na Tabela 2, a sementeira, assim, 2.500 células / poço. Fazer o mesmo procedimento para OVCAR3 e MDA-MB-231 linhas celulares. </li><li> Após 24 horas lavar os poços com 1 x DPBS e adicionar 50 ul de concentrações crescentes de nanopartículas nas cavidades como se mostra na Tabela 2. Prepare-se diferentes concentrações de nanopartículas pela adição de 20, 100, e 180 ul de suspensão de nanopartículas de 2.4.2 para a DMEM obter um volume final de 2 ml, que origina concentrações de nanopartículas de 0,4 x 10 -4 mg / ml, 2,0 x 10 -4 mg / mL, e 3,6 x 10 -4 mg / ml, respectivamente. Cada linha celular tem triplicado para cada concentração de nanopartículas. </li></ol></li><li> Medir a viabilidade celular no escuro <ol><li> Adicionar 10 ul de MTT a 0 hr a placa imediatamente após a adição de nanopartículas. Incubar a placa durante 4 horas para cryst formazanpara formar als. Adicionar solução de solubilização 50 ul nos poços. Incubar a placa durante 6 horas para dissolver os cristais de formazano. </li><li> Medir a viabilidade das células da placa de 0 h, gravando a absorvância a 570 nm com um leitor de microplacas. </li><li> Por placa de 24 h, lavar as células com DPBS e 1x adicionar 50 ul meios em cada poço de incubação depois de 24 horas com nanopartículas. Adicionar MTT e ler a placa conforme explicado em 4.2.1 e 4.2.2. </li><li> Por 48 horas, 72 horas, e 96 placas de RH, lavar as células com 1x DPBS e adicionar 50 ul mídia nas cavidades após 24 hr de incubação com nanopartículas. Incubar as células para os períodos restantes. </li><li> 4.2.5) medir a viabilidade celular nos pontos de tempo particulares, tal como explicado nos pontos 4.2.1 e 4.2.2. </li><li> Repita a experiência completa para 3 vezes (n = 3) </li></ol></li></ol> 5. medir a viabilidade celular após a TFD <ol><li> Contar as células e cultura em placas de 96 poços. <ol><li> Rotular um conjunto de 9Placas de 6 poços, como mostrado na Tabela 3, tanto para as placas 71 de TE e A549 + + OVCAR3 MDA-MB-231 placas. A disposição das placas vai ser o mesmo que o indicado em 4.1.3. </li><li> Semear as placas de 96 poços como explicado no ponto 4.1 com o mesmo layout como mostra a Tabela 2 na seção 4.1.2. </li><li> Após 24 horas, adicionar nanopartículas para as placas como explicado no ponto 4.1.4. </li><li> 24 h após a adição de nanopartículas de lavar as células com DPBS e 1x adicionar 50 ul de HBSS a cada poço. </li><li> Irradiam-se as placas com as respectivas doses de luz, como explicado em 3.2.3. </li><li> Substituir o HBSS com 50 ul de meio DMEM suplementado com FBS a 10% e incuba-se as placas para os respectivos períodos de tempo após a TFD. </li><li> Após cada período de tempo medir a viabilidade celular, como explicado em 4.2.1 e 4.2.2. </li></ol></li></ol> 6. Microscopia de Fluorescência <ol><li> A absorção de nanopartículas <ol><li> Acender as lâmpadas do microscópio umaND o laser 30 min antes de imagem. Colocar a placa de petri contendo as células fixadas (como explicado na secção 3.1) na fase do microscópio. </li><li> Recolha a fluorescência a partir de nanopartículas de DAPI e por utilização de filtros, como mostrado na Tabela 4. Sobrepor a fase contraste, nanopartículas e DAPI imagens no software ImageJ. </li></ol></li><li> Detecção de ROS <ol><li> Acender as lâmpadas do microscópio 30 min antes de imagem. Colocar a placa de petri contendo as células (tal como explicado na secção 3.2) na fase do microscópio. </li><li> Recolhe-se o de fluorescência a partir das nanopartículas, DAPI, e o reagente de detecção ROS usando filtros, como mostrado na Tabela 4. Overlay o contraste de fase, de nanopartículas, de DAPI e ROS detectar imagens de reagentes em software ImageJ. </li></ol></li><li> Apoptose e necrose por PI e anexina V FITC <ol><li> Acender as lâmpadas do microscópio 30 min antes de imagem. Colocar a placa de Petri contendo as células (tal como explicado nosecção 3.3) na fase do microscópio. </li><li> Recolhe-se o de fluorescência a partir das nanopartículas, DAPI, PI e Anexina V FITC usando filtros, como mostrado na Tabela 4. Overlay o contraste de fase, de nanopartículas, DAPI, PI e Anexina V-FITC imagens no software ImageJ. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Para conseguir a absorção de nanopartículas, foi necessário manter algumas medidas críticas enquanto a fabricação das nanopartículas. Uma solução de M MEH-PPV 10 -6 (misturado com 50% em peso PCBM) em THF foi preparada para injectar água Dl, uma vez que foi observado que a concentração desta solução desempenha um papel importante na determinação do tamanho das nanopartículas sendo formada. A concentração foi verificada por espectroscopia de Uv-vis. Note-se que no passo 2.1.3 protocolo foi ...

Em Terapia Fotodinâmica (PDT) fotossensibilizantes são administrados para atingir o tecido, e após a exposição à luz do fotossensibilizador gera espécies reativas de oxigênio (ROS). ROS espécies, tais como oxigénio atómico e superóxido pode induzir estresse oxidativo e danos estruturais após a células e tecidos 1-4. Devido à sua facilidade de aplicação desse método tem sido activamente investigados e ensaios clínicos foram realizados 5,6. No entanto, os problemas significativos tais como toxicidade no escuro dos sensibilizadores, a sensibilidade do doente a luz (devido a uma distribuição não selectiva do sensibilizador), e hidrofobicidade dos sensibilizadores (o que leva à redução da biodisponibilidade e potencial toxicidade aguda) permanecem. Relatamos aqui um método para a fabricação e in vitro de avaliação da realização de nanopartículas de polímero misturado com fulereno como os fotossensibilizadores próxima geração para PDT. As nanopartículas são formadas por auto-agregação deo polímero semicondutor MEH-PPV (poli [2-metoxi-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-fenilenovinileno]) com o PCBM fulereno (fenil-C 61 éster metílico do ácido butírico), quando estes materiais dissolvidos numa compatível solvente são rapidamente injectadas num solvente não-compatível (Figura 1A). A escolha de MEH-PPV como o polímero hospedeiro é motivada pelo seu elevado coeficiente de extinção que leva a altas taxas de formação de tripleto, e ao mesmo tempo eficiente e ultra-rápida de carga e energia transferência para o PCBM fulereno 7. Estas propriedades são ideais para a sensibilização de oxigénio atómico e formação de superóxido no PDT. Fulereno tem de facto sido aplicado no PDT, tanto na forma molecular e nanopartículas de 8-13. No entanto, a citotoxicidade grave tem dificultado o desenvolvimento adicional 12. Aqui nós mostramos que encapsular o fulereno em uma matriz hospedeira de MEH-PPV para produzir nanopartículas compostas MEH-PPV / PCBM resultados em um material de sensibilização PDT que inão é citotóxico intrinsecamente, mostra especificidade para células cancerosas devido ao tamanho das nanopartículas e carga superficial, e os rendimentos de tratamento altamente eficaz na TFD doses baixas de luz devido às propriedades fotofísicas acima mencionados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV)</td>
			<td>Sigma Aidrich</td>
			<td>536512-1G</td>
			<td>average Mn&#160;150,000-250,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[6,6]-Phenyl C61&#160;butyric acid methyl ester (PCBM)</td>
			<td>Sigma Aidrich</td>
			<td>684449-500MG</td>
			<td>&#62; 99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>EMD</td>
			<td>TX0284-6</td>
			<td>Drisolv</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>National Scientific Company</td>
			<td>37510-1</td>
			<td>For filtration of MEH-PPV solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-495</td>
			<td>25 mm, 0.2 &#181;m, PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81320</td>
			<td>For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium/Ham&#39;s F-12 50/50 Mix (DMEM)</td>
			<td>Corning (VWR)</td>
			<td>45000-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS)</td>
			<td>Quality Biological (VWR)</td>
			<td>10128-740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium (DPBS)</td>
			<td>Corning (VWR)</td>
			<td>45000-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS)</td>
			<td>Corning (VWR)</td>
			<td>45000-736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1X 0.25%</td>
			<td>Corning (VWR)</td>
			<td>45000-664</td>
			<td>Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>15710</td>
			<td>16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>&#160;Biotium VWR</td>
			<td>89139-054</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 culture flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-856</td>
			<td>for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-771</td>
			<td>for MTT assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes with Vents</td>
			<td>Greiner Bio-One (VWR)</td>
			<td>82050-538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V FITC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13199</td>
			<td>dye for apoptosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltiter 96 non-R 1000 assays</td>
			<td>Promega (VWR)</td>
			<td><a href="https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=PAG4000">PAG4000</a></td>
			<td>MTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10444</td>
			<td>For ROS detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-vis spectrometer</td>
			<td>Agilent 8453</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrometer</td>
			<td>NanoLog HoribaJobin Yvon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering</td>
			<td>PD2000DLS, Precision detector</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>NuAir DH Autoflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss Axioskop2</td>
			<td></td>
			<td>63X oil immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epiluminescence microscope</td>
			<td>Olympus IX71</td>
			<td></td>
			<td>60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solar Simulator</td>
			<td>Newport 67005 Oriel Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reference solar cell</td>
			<td>Oriel&#160;</td>
			<td></td>
			<td>VLSI Standards Incorporated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek Ex808</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific Partnership</td>
			<td>3200</td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photodynamic therapy with blended conducting polymer/fullerene nanoparticle photosensitizers

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT) is reported. The nanoparticles are formed by hydrophobic interaction of the semiconducting polymer MEH-PPV (poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene]) with the fullerene PCBM (phenyl-C61-butyric acid methyl ester) in the presence of a non-compatible solvent. MEH-PPV has a high extinction coefficient that leads to high rates of triplet formation, and efficient charge and energy transfer to the fullerene PCBM. The latter processes enhance the efficiency of the PDT system through fullerene assisted triplet and radical formation, and ultrafast deactivation of MEH-PPV excited stated. The results reported here show that this nanoparticle PDT sensitizing system is highly effective and shows unexpected specificity to cancer cell lines.

Absorção e citotoxicidade intrínseca de nanopartículas Os 50% em peso de nanopartículas misturados MEH-PPV / PCBM foram incubadas com TE 71, MDA-MB-231, A549 e linhas de células OVCAR3. O nível PCBM mistura foi escolhido como 50% em peso PCBM, o que foi mostrado para fornecer propriedades de carga e de transferência de energia ideal entre polímeros e conjugados fulerenos 14. As imagens de fluorescência de absorção de nanopartículas estão apresentados na</stro...

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Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers

This protocol describes a method for the fabrication of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene. These nanoparticles were investigated for their potential use as a next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT).

Terapia Fotodinâmica com Blended polímero condutor / Fullerene Nanoparticle Fotossensibilizadores

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

8.4K visualizações.  University of Central Florida. This protocol describes a method for the fabrication of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene. These nanoparticles were investigated for their potential use as a next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT). 

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Conducting Miller-Urey Experiments

In 1953, Stanley Miller reported the production of biomolecules from simple gaseous starting materials, using an apparatus constructed to simulate the primordial Earth&#39;s atmosphere-ocean system. Miller introduced 200 ml of water, 100 mmHg of H2, 200 mmHg of CH4, and 200 mmHg of NH3 into the apparatus, then subjected this mixture, under reflux, to an electric discharge for a week, while the water was simultaneously heated. The purpose of this manuscript is to provide the reader with a general experimental protocol that can be used to conduct a Miller-Urey type spark discharge experiment, using a simplified 3 L reaction flask. Since the experiment involves exposing inflammable gases to a high voltage electric discharge, it is worth highlighting important steps that reduce the risk of explosion. The general procedures described in this work can be extrapolated to design and conduct a wide variety of electric discharge experiments simulating primitive planetary environments.

The Miller-Urey experiment was a pioneering study regarding the abiotic synthesis of organic compounds with possible relevance to the origins of life. Simple gases were introduced into a glass apparatus and subjected to an electric discharge, simulating the effects of lightning in the primordial Earth&#8217;s atmosphere-ocean system. The experiment was conducted for one week, after which, the samples collected from it were analyzed for the chemical building blocks of life.

Realização de experimentos de Miller-Urey

In 1953, Stanley Miller reported the production of biomolecules from simple gaseous starting materials, using an apparatus constructed to simulate the ...

Química

A Technique to Functionalize and Self-assemble Macroscopic Nanoparticle-ligand Monolayer Films onto Template-free Substrates

This protocol describes a self-assembly technique to create macroscopic monolayer films composed of ligand-coated nanoparticles1,2. The simple, robust and scalable technique efficiently functionalizes metallic nanoparticles with thiol-ligands in a miscible water/organic solvent mixture allowing for rapid grafting of thiol groups onto the gold nanoparticle surface. The hydrophobic ligands on the nanoparticles then quickly phase separate the nanoparticles from the aqueous based suspension and confine them to the air-fluid interface. This drives the ligand-capped nanoparticles to form monolayer domains at the air-fluid interface.&#160; The use of water-miscible organic solvents is important as it enables the transport of the nanoparticles from the interface onto template-free substrates.&#160; The flow is mediated by a surface tension gradient3,4 and creates macroscopic, high-density, monolayer nanoparticle-ligand films.&#160; This self-assembly technique may be generalized to include the use of particles of different compositions, size, and shape and may lead to an efficient assembly method to produce low-cost, macroscopic, high-density, monolayer nanoparticle films for wide-spread applications.

A simple, robust and scalable technique to functionalize and self-assemble macroscopic nanoparticle-ligand monolayer films onto template-free substrates is described in this protocol.

Uma técnica para funcionalizar e auto-montar macroscópicas Nanopartículas-ligante monocamada Films em substratos sem Modelo

This protocol describes a self-assembly technique to create macroscopic monolayer films composed of ligand-coated nanoparticles1,2. The simple, robust and ...

Synthesis and Testing of Supported Pt-Cu Solid Solution Nanoparticle Catalysts for Propane Dehydrogenation

A convenient method for the synthesis of bimetallic Pt-Cu catalysts and performance tests for propane dehydrogenation and characterization are demonstrated here. The catalyst forms a substitutional solid solution structure, with a small and uniform particle size around 2 nm. This is realized by careful control over the impregnation, calcination, and reduction steps during catalyst preparation and is identified by advanced in situ synchrotron techniques. The catalyst propane dehydrogenation performance continuously improves with increasing Cu:Pt atomic ratio.

A convenient method for the synthesis of 2 nm supported bimetallic nanoparticle Pt-Cu catalysts for propane dehydrogenation is reported here. In situ synchrotron X-ray techniques allow for the determination of the catalyst structure, which is typically unobtainable using laboratory instruments.

Síntese e Teste de Solução Sólida de Pt-Cu Suportada Catalisadores de Nanopartículas para Desidrogenação de Propano

A convenient method for the synthesis of bimetallic Pt-Cu catalysts and performance tests for propane dehydrogenation and characterization are ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully understood. We have traced the trajectories of individual nanoparticles using liquid-cell transmission electron microscopy (TEM) to investigate the mechanism of the assembly process. Herein, we present the protocols used for liquid-cell TEM studies of the self-assembly mechanism. First, we introduce the detailed synthetic protocols used to produce uniformly sized platinum and lead selenide nanoparticles. Next, we present the microfabrication processes used to produce liquid cells with silicon nitride or silicon windows and then describe the loading and imaging procedures of the liquid-cell TEM technique. Several notes are included to provide helpful tips for the entire process, including how to manage the fragile cell windows. The individual motions of nanoparticles tracked by liquid-cell TEM revealed that changes in the solvent boundaries caused by evaporation affected the self-assembly process of nanoparticles. The solvent boundaries drove nanoparticles to primarily form amorphous aggregates, followed by flattening of the aggregates to produce a 2-dimensional (2D) self-assembled structure. These behaviors are also observed for different nanoparticle types and different liquid-cell compositions.

Here we introduce experimental protocols for the real-time observation of a self-assembly process using liquid-cell transmission electron microscopy.

Microscopia eletrônica de transmissão de líquido-celular para rastreamento auto-montagem de nanopartículas

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully ...

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity and convenient colorimetric readout. However, high densities of nanoparticles are typically needed for detection. The available synthesis-based enhancement protocols are either limited to gold and silver nanoparticles or rely on precise enzymatic control and optimization. Here, we present a protocol to enhance the colorimetric readout of gold, silver, silica, and iron oxide nanoprobes. It was observed that the colorimetric signal can be improved by up to a 10000-fold factor. The basis for such signal enhancement strategies is the chemical reduction of Au3+ to Au0. There are several chemical reactions that enable the reduction of Au3+ to Au0. In the protocol, Good&#39;s buffers and H2O2 are used and it is possible to favor the deposition of Au0 onto the surface of existing nanoprobes, in detriment of the formation of new gold nanoparticles. The protocol consists of the incubation of the microarray with a solution consisting of chloroauric acid and H2O2 in 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid pH 6 buffer following the nanoprobe-based detection assay. The enhancement solution can be applied to paper and glass-based sensors. Moreover, it can be used in commercially available immunoassays as demonstrated by the application of the method to a commercial allergen microarray. The signal development requires less than 5 min of incubation with the enhancement solution and the readout can be assessed by naked eye or low-end image acquisition devices such as a table-top scanner or a digital camera.

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

In this work, a protocol for signal enhancement of nanoprobe-based biosensing is presented. The protocol is based on the reduction of chloroauric acid onto the surface of existing nanoprobes that consist of gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles.

Sinal de nanossondas rápida realce pela síntese de nanopartículas de ouro em Situ

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This work presents the preparation of methionine functionalized biocompatible block copolymers via RAFT polymerization. Firstly, N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide-b-N-(3-aminopropyl)methacrylamide (BNHEMA-b-APMA, BA) was synthesized via RAFT polymerization using 4,4&#8217;-azobis(4-cyanovaleric acid) (ACVA) as an initiating agent and 4-cyanopentanoic acid dithiobenzoate (CTP) as the chain transfer agent. Subsequently, N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide-b-N-(3-guanidinopropyl)methacrylamide (methionine grafted BNHEMA-b-GPMA, mBG) was prepared by modifying amine groups in APMA with methionine and guanidine groups. Three kinds of block polymers, mBG1, mBG2, and mBG3, were synthesized for comparison. A ninhydrin reaction was used to quantify the APMA content; mBG1, mBG2, and mBG3 had 21%, 37%, and 52% of APMA, respectively. Gel permeation chromatography (GPC) results showed that BA copolymers possess molecular weights of 16,200 (BA1), 20,900(BA2), and 27,200(BA3) g/mol. The plasmid DNA (pDNA) complexing ability of the obtained block copolymer gene carriers was also investigated. The charge ratios (N/P) were 8, 16, and 4 when pDNA was complexed completely with mBG1, mBG2, mBG3, respectively. When the N/P ratio of mBG/pDNA polyplexes was higher than 1, the Zeta potential of mBG was positive. At an N/P ratio between 16 and 32, the average particle size of mBG/pDNA polyplexes was between 100-200 nm. Overall, this work illustrates a simple and convenient protocol for the block copolymer carrier synthesis.

This work presents the preparation of methionine functionalized biocompatible block copolymers (mBG) via the reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) method. The plasmid DNA complexing ability of the obtained mBG and their transfection efficiency were also investigated. The RAFT method is very beneficial for polymerizing monomers containing special functional groups.

Methionine Funcionalizou o bloco biocompatible copolímeros para a entrega alvejada do ADN do plasmid

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This ...

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in physiological fluids induce denaturation and degradation of self-assembled DNA nanostructures. In non-viral gene delivery, enzymatic degradation of DNA is overcome by the encapsulation of the negatively charged DNA in a cationic shell. Herein, inspired by gene delivery advancements, a simple, one-step and robust methodology is presented for the stabilization of DNA origami nanostructures by coating them with chitosan and linear polyethyleneimine. The polycation coating efficiently protects DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media. This method also preserves the full addressability of enzyme- and aptamer-based functionalization of DNA nanostructures.

Here, a protocol for the protection of DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media using natural cationic polysaccharide chitosan and synthetic linear polyethyleneimine (LPEI) coatings is presented.

Gene-terapia inspirou Polycation revestimento para proteção de nanoestruturas de Origami de DNA

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

Gold Nanoparticle Modified Carbon Fiber Microelectrodes for Enhanced Neurochemical Detection

For over 30 years, carbon-fiber microelectrodes (CFMEs) have been the standard for neurotransmitter detection. Generally, carbon fibers are aspirated into glass capillaries, pulled to a fine taper, and then sealed using an epoxy to create electrode materials that are used for fast scan cyclic voltammetry testing. The use of bare CFMEs has several limitations, though. First and foremost, the carbon fiber contains mostly basal plane carbon, which has a relatively low surface area and yields lower sensitivities than other nanomaterials. Furthermore, the graphitic carbon is limited by its temporal resolution, and its relatively low conductivity. Lastly, neurochemicals and macromolecules have been known to foul at the surface of carbon electrodes where they form non-conductive polymers that block further neurotransmitter adsorption. For this study, we modify CFMEs with gold nanoparticles to enhance neurochemical testing with fast scan cyclic voltammetry. Au3+ was electrodeposited or dipcoated from a colloidal solution onto the surface of CFMEs. Since gold is a stable and relatively inert metal, it is an ideal electrode material for analytical measurements of neurochemicals. Gold nanoparticle modified (AuNP-CFMEs) had a stability to dopamine response for over 4 h. Moreover, AuNP-CFMEs exhibit an increased sensitivity (higher peak oxidative current of the cyclic voltammograms) and faster electron transfer kinetics (lower &#916;EP or peak separation) than bare unmodified CFMEs. The development of AuNP-CFMEs provides the creation of novel electrochemical sensors for detecting fast changes in dopamine concentration and other neurochemicals at lower limits of detection. This work has vast applications for the enhancement of neurochemical measurements. The generation of gold nanoparticle modified CFMEs will be vitally important for the development of novel electrode sensors to detect neurotransmitters in vivo in rodent and other models to study neurochemical effects of drug abuse, depression, stroke, ischemia, and other behavioral and disease states.

In this study, we modify carbon-fiber microelectrodes with gold nanoparticles to enhance the sensitivity of neurotransmitter detection.

Nanopartícula de ouro modificado microeletrodos de fibra de carbono para detecção neuroquímica reforçada

For over 30 years, carbon-fiber microelectrodes (CFMEs) have been the standard for neurotransmitter detection. Generally, carbon fibers are aspirated into ...

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). Characterization needs to be thorough and the technique chosen should be well-suited to the property to be determined, the material being analyzed and the medium in which it is present. Furthermore, the instrument operation and methodology need to be well-developed and clearly understood by the user to avoid data collection errors. Any discrepancies in the applied method or procedure can lead to differences and poor reproducibility of obtained data. This paper aims to clarify the method to measure the hydrodynamic diameter of gold nanoparticles by means of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). This study was carried out as an inter-laboratory comparison (ILC) amongst seven different laboratories to validate the standard operating procedure&#8217;s performance and reproducibility. The results obtained from this ILC study reveal the importance and benefits of detailed standard operating procedures (SOPs), best practice updates, user knowledge, and measurement automation.

The protocol described here aims to measure the hydrodynamic diameter of spherical nanoparticles, more specifically gold nanoparticles, in aqueous media by means of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). The latter involves tracking the movement of particles due to Brownian motion and implementing the Stokes-Einstein equation to obtain the hydrodynamic diameter.

Análise de rastreamento de nanopartículas de nanopartículas de ouro na mídia aquosa através de uma comparação inter-laboratorial

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

Gold Nanoparticle Synthesis

Gold nanoparticles (Au nanoparticles) that are ~12 nm in diameter were synthesized by rapidly injecting a solution of 150 mg (0.15 mmol) of tetrachloroauric acid in 3.0 g (3.7 mmol, 3.6 mL) of oleylamine (technical grade) and 3.0 mL of toluene into a boiling solution of 5.1 g (6.4 mmol, 8.7 mL) of oleylamine in 147 mL of toluene. While boiling and mixing the reaction solution for 2 hours, the color of the reaction mixture changed from clear, to light yellow, to light pink, and then slowly to dark red. The heat was then turned off, and the solution was allowed to gradually cool down to room temperature for 1 hour. The gold nanoparticles were then collected and separated from the solution using a centrifuge and washed three times; by vortexing and dispersing the gold nanoparticles in 10 mL portions of toluene, and then precipitating the gold nanoparticles by adding 40 mL portions of methanol and spinning them in a centrifuge. The solution was then decanted to remove any remaining byproducts and unreacted starting materials. Drying the gold nanoparticles in a vacuum environment produced a solid black pellet; which could be stored for long periods of time (up to one year) for later use, and then redissolved in organic solvents such as toluene.

A protocol for synthesizing ~12 nm diameter gold nanoparticles (Au nanoparticles) in an organic solvent is presented. The gold nanoparticles are capped with oleylamine ligands to prevent agglomeration. The gold nanoparticles are soluble in organic solvents such as toluene.