Como uma infinidade de terapias inovadoras estão sendo investigadas para o tratamento da dor crônica, nosso protocolo fornece conceitos cruciais para a padronização das cirurgias necessárias para induzir dor neuropática. A ligadura parcial do nervo ciático, ou LSPS, é um modelo vantajoso para o estudo da dor neuropática, pois reproduz muitos sintomas observados em humanos com dor neuropática. Como a PNSP reproduz muitos sintomas observados em humanos com dor neuropática, esse protocolo fornece conceitos cruciais para estudar e desenvolver novas terapias para o tratamento da dor.
Quem demonstrará o procedimento será Kevin Cheng, doutorando em meu laboratório. Para começar, habitue os ratos ao aparelho de teste de Von Frey por uma hora antes do teste, colocando-os em caixas de plexiglass transparentes em uma malha de arame na mesma sala da sala de teste. Aplicar uma série de monofilamentos finos calibrados perpendicularmente à superfície da plantadora da pata traseira ipsilateral do PSNL dos animais mantidos em gaiolas de malha de arame suspensas.
Determinar o limiar de retirada aumentando ou diminuindo sequencialmente a força do estímulo correspondente ao tamanho do filamento. Aumente o tamanho do filamento quando a resposta for negativa e diminua o tamanho do filamento quando o animal retirar a pata. Relate respostas negativas e positivas na folha de dados e teste a mesma pata quatro vezes com filamentos diferentes após a primeira resposta positiva.
Habitue os ratos ao aparelho de teste Hargreaves durante uma hora antes do teste, colocando-os em caixas de plexiglass transparentes na mesma sala que a sala de ensaio. Estabelecer as latências basais de retirada da pata usando o aparelho Hargreaves. Focalize uma fonte de calor radiante na superfície da planta da pata traseira ipsilateral à PSNL e inicie a estimulação.
Quando o animal retirar a pata, aguarde um detector de movimento para interromper o estímulo e parar o temporizador. Ajustar a intensidade da fonte de calor para obter uma linha de base de latência de retirada da pata de aproximadamente 10 segundos. Em seguida, registre o tempo de retirada em uma tabela.
Ajuste a placa quente para 52 graus Celsius. Coloque o animal na câmara de ensaio e inicie um cronómetro. Observe os comportamentos nocifensivos e pare o cronômetro assim que o comportamento nocifensivo for observado.
Em seguida, retire o animal da câmara e registre a latência para esse comportamento. Certifique-se de limpar o aparelho de qualquer urina entre cada animal testado para evitar afetar a temperatura do estímulo térmico. Limpar a câmara de teste com etanol 70% entre os animais para reduzir o impacto comportamental dos odores.
Para fazer um gancho de vidro nervoso, ligue o queimador de bunsen. Segure uma extremidade da haste de vidro no fogo em uma das mãos. À medida que esta haste de vidro derrete, use outra haste de vidro na outra mão para guiar e puxar o vidro de fusão na primeira haste.
Retire a primeira haste de vidro do fogo e deixe a extremidade da porção derretida rolar naturalmente para dentro para formar uma pequena forma de esfera usando a segunda haste de vidro. Aperte os dedos de uma pata traseira com uma pinça para garantir a ausência do reflexo da pata e verifique o reflexo de piscar da córnea antes de aplicar pomada oftálmica lubrificante. Ao escolher de que lado realizar a cirurgia, modele a pata traseira do animal ao redor da região da coxa, inferiormente em direção à patela, superiormente em direção ao quadril e acima do fêmur.
Em seguida, limpe três vezes com clorexidina em uma direção com três gazes separadas alternadas com soro fisiológico estéril quente. Em seguida, deslize a perna através de uma fenda feita em um drape estéril de 10 por 10 centímetros para criar um campo estéril ao redor da perna de escolha. Usando tesoura cirúrgica fina fazer um pequeno corte de dois milímetros da pele na linha média da face lateral da coxa.
Deslize a tesoura sob a pele em um movimento circular para romper a fáscia e criar uma folga, ampliando o espaço da incisão. Em seguida, usando pinças de amarração criar uma incisão afiada de um centímetro de profundidade verticalmente em um ângulo de 90 graus nos músculos da coxa. Em seguida, insira a tesoura pequena fina na mesma incisão também em um ângulo de 90 graus e espalhe-as suavemente para separar os músculos até que o nervo ciático seja visualizado.
Localize o nervo ciático correndo paralelo à coxa vertical na direção do quadril ao joelho. Retire a tesoura da pinça de amarração do corpo antes de prosseguir. Use a pinça extra fina no gancho de vidro do nervo para isolar o nervo por baixo.
Liberte cuidadosamente os nervos dos tecidos conjuntivos circundantes em um local próximo ao trocanter do fêmur, que está mais próximo do quadril e mais distante do joelho. Deixe o nervo descansar sobre a haste de vidro e certifique-se de que a extremidade da haste impede que o nervo se desloque. Coloque um nó cirúrgico para amarrar um terço da largura do nervo ciático usando uma sutura de nove zero de náilon antes de se dividir nos ramos fibular comum, tibial e sural.
Deslize cuidadosamente o nervo para fora da haste de vidro assim que o nó estiver completo e coloque-o de volta no local original no nível abaixo dos músculos separados. Em seguida, sutura da incisão muscular com fio absorvível poliglicólico cinco zero. Separadamente, sutura da pele com fio de polipropileno seis zero inabsorvível.
Em seguida, registre o tempo de parada da cirurgia e da anestesia. Permita que o rato acorde sozinho numa gaiola de recuperação antes de o devolver a uma nova gaiola limpa. Use o teste de Von Frey, Hargreaves ou placa quente para avaliar a hipersensibilidade térmica e mecânica e sua potencial reversão.
Camundongos submetidos à cirurgia de NPSP demonstraram limiares mais baixos para estímulos mecânicos em comparação com animais simulados ao longo de 28 dias. Resultados semelhantes foram obtidos com a avaliação da hipersensibilidade térmica. As latências de retirada da pata após exposição ao estímulo térmico radiante foram aumentadas nos animais da NPPS, bem como as latências de retirada quando os animais foram colocados em uma placa de 52 graus Celsius.
Os grupos injetados com duas doses diferentes de morfina apresentaram reversão da hipersensibilidade, que durou de uma a duas horas. A hipersensibilidade mecânica retornou aos valores basais quatro horas após a injeção de morfina. Quando duas doses diferentes de ibuprofeno foram administradas intraperitonealmente aos camundongos, os resultados demonstraram menor hipersensibilidade mecânica em comparação com camundongos injetados com solução salina.
Limitar o dano adicional ao nervo é essencial, pois pode afetar os limiares sensoriais da dor. O experimentador deve prestar atenção especial e usar o gancho de vidro para reduzir danos não intencionais Após esse procedimento, esse modelo de dor neuropática crônica pode ser usado para identificar e caracterizar o efeito antinociceptivo de fármacos, levando ao desenvolvimento de novas terapias para o tratamento da dor.
