Esta pesquisa demonstra uma nova abordagem para o estudo da terapêutica e patobiologia do câncer de apêndice em um ambiente pré-clínico. Esses métodos podem ser mais amplamente aplicáveis ao estudo de outras neoplasias. O câncer de apêndice é difícil de estudar, dada sua baixa incidência na ausência de apêndice em camundongos para modelagem da doença.
Esta técnica permite o estudo das interações celulares dentro do microambiente tumoral. Esse método pode ser aplicado para estudar a biologia de vários tipos de cânceres que têm propensão a metastatizar para o omento, como os cânceres colorretal e de ovário. Comece preparando os meios de transporte e cultura.
Após a chegada do tecido, transferir os tecidos tumorais do pseudomixoma peritonei para 35 DMEM completos contendo placas de seis centímetros de diâmetro. Além de remover qualquer mucina liquificada, ou regiões de tecido altamente mucinoso, remova qualquer tecido que seja difícil de cortar com um bisturi. Corte nódulos de tecido tumoral aproximadamente em pedaços menores de um centímetro cúbico.
para a preparação de agarose e incorporação de tecidos, preparar uma solução a 5% de agarose de baixo derretimento em PBS sem soro fetal bovino ou FBS no mesmo dia, se os tecidos chegarem. Adicione a solução líquida de agarose a 5% às placas de seis centímetros contendo dois a três espécimes tumorais menores até cobrir o espécime. Coloque os tecidos embutidos em um refrigerador de quatro graus Celsius por 30 minutos.
Desmonte os espécimes de tecido no vibratome, retire o trado solidificado da geladeira e corte os cubos de agarose ligeiramente maiores do que a largura do tecido usando um bisturi. Aplique super cola no estágio de vibratómico e coloque suavemente o cubo de agarose sobre a super cola por um a dois minutos para fixação. Fixe a lâmina no vibratomo e ajuste a espessura da seção de tecido para aproximadamente 150 a 250 mícrons para obter imagens a jusante ideais.
Para cultivar os cortes de tecido, prepare uma placa de inserção permeável adicionando dois mililitros de meio DMEM completo acima da membrana permeável e três mililitros abaixo da membrana permeável. Em seguida, levante suavemente as fatias de tecido para fora da câmara de corte do vibratomo usando um pincel fino e coloque de duas a quatro fatias em pratos de cultura permeáveis contendo DMEM completo. Cultive as fatias por até sete dias a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.
Durante a troca de meios, a cada 24 horas, adicionar bortezomib como controle para morte celular, e quimioterapias testáveis 5-Fluorouracil, ou 5-FU, aos meios de cultura para realizar a intervenção farmacológica. Coloque fatias tumorais para análise de imagem confocal em um único poço de uma placa de 12 poços contendo PBS com 1% de SFB. Para experimentos de imagem de cálcio, em vez de PBS, incube as fatias em uma solução extra celular de cálcio.
Coloração de amostras com corantes de imagem para determinar a viabilidade de cortes de tecido. Incubar por 10 minutos a uma hora após a adição do corante de viabilidade. Após a incubação, transfira as fatias para uma placa de Petri com fundo de vidro opticamente transparente contendo PBS com FBS a 1% para ser usada para aquisição de imagens em um dispositivo de imagem confocal.
Corte um pequeno pedaço da extremidade de uma ponta de pipeta de um mililitro para alargar a abertura, permitindo uma dissociação mecânica vigorosa por pipetagem. Incubar fatias a 37 graus Celsius com rotação por cinco a 15 minutos em um mililitro de tampão de digestão, com ruptura vigorosa do tecido duas a três vezes durante a incubação usando dissociação mecânica. Uma vez que o tecido é digerido, transfira o tecido rompido com o meio de digestão em um filtro de 70 micrômetros colocado em cima de um tubo cônico de 50 mililitros.
Escolha peças maiores usando pinças estéreis ou uma pipeta. Usando o backend rombo de uma seringa plástica de cinco mililitros, amasse quaisquer fatias maiores não dissociadas e lave-as com quatro mililitros de PBS contendo 2% FBS. Tome o sobrenadante celular dissociado e centrifuga a 300G por cinco a 10 minutos.
Retire o sobrenadante e lave o pellet com um mililitro de PBS contendo 2% FBS. Para preparar a amostra para citometria de fluxo, adicionar o tampão de bloqueio contendo 50 microlitros de bloqueio FC humano e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Realizar coloração extracelular usando os respectivos anticorpos em 50 microlitros de PBS contendo 2% de SFB.
Alíquota de cinco mililitros de meio completo para condições de controle e tratamento. Nas duas a quatro fatias banhadas nos pratos permeáveis, adicione os meios das alíquotas de tratamento de controle e as terapias combinadas adicionais a serem usadas para análise de viabilidade a jusante, morta viva. Deixar fatias de tecido em uma cultura contendo DMEM completo por dois a cinco dias, trocando de meio, bem como bortezomib e 5-FU a cada dois dias.
Para análise de viabilidade luminescente, adicione 500 microlitros de PBS em um prato de 12 poços e transfira as fatias de tecido sequencialmente combinadas para a solução PBS usando um pincel ou uma pipeta de um mililitro. Remova o PBS das fatias. Adicionar 500 microlitros da solução de viabilidade luminescente por condição e incubar com uma rotação lenta no agitador à temperatura ambiente durante 30 minutos antes de ler a luminescência utilizando um leitor de placas de luminescência.
A coloração de mucina em cortes de tecido foi visualizada usando coloração periódica por deslocamento ácido e anticorpos específicos para mucina. A incubação em calceína AM e iodeto de propídio determinou a saúde e a viabilidade. Os núcleos se sobrepuseram às células que proliferaram durante o cultivo.
Estes resultados foram quantificados para determinar o número de células em proliferação dentro do corte tumoral. As fatias incubadas em anticorpo conjugado CD11b PE e Fluo-4 AM, marcaram as células imunes locais em CTU. Imagens em escala pseudocolorida mostrando níveis de cálcio intracelular permitiram visualizar níveis diferenciais de cálcio intracelular.
A atividade espontânea rastreada e o tempo decorrido para antes, durante e após a resposta intercelular de cálcio dentro da célula imune CD11b positiva destacada são mostrados aqui. Os traços brutos de respostas de cálcio na célula imune CD11b, juntamente com outras células responsivas e não responsivas foram quantificados. Resultados representativos da imunotipagem de uma amostra tumoral de paciente com pseudomixoma peritoneal são mostrados aqui.
A quantificação do perfil imunológico tumoral mostrou que o espécime doador 337 apresenta altos níveis de macrófagos M2, indicando que a utilização de cortes de tecido derivados do peritônio do pseudomixoma permitiu interrogar a paisagem celular única do doador das amostras tumorais dos pacientes. A farmacotipagem e a análise a jusante de fatias de tecido de tecidos humanos de pseudomixoma peritonei mostraram a morte de células em fatias tumorais, confirmada pela análise de citotoxicidade e imagens confocais em túnel. Em resposta à droga citotóxica, bortezomib e 5-fluorouracil.
A análise luminescente da viabilidade foi realizada por meio de cortes sequencialmente pareados. A produção bem-sucedida de fatias de tumores mucinosos requer dissecção meticulosa e remoção de componentes celulares e do tecido acelular, como gordura e tecido denso da parede abdominal. Esta técnica pode permitir a modelagem de interações entre células cancerosas e múltiplos tipos celulares no microambiente tumoral, tais como interações adiposas, vasculares e imunes.
