Nosso protocolo é compatível com outros métodos de análise molecular e permite a avaliação de como as drogas afetam a viabilidade de fatias de tecido em tato e o desempenho da triagem de rendimento médio. A principal vantagem dessa técnica é que podemos medir a viabilidade de uma fatia de tecido inteira em tempo real com muito pouco pré ou pós-processamento. Esta técnica acelera o desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos e oncologia testando candidatos a medicamentos ou fatias de tecidos adquiridos diretamente de amostras de tecido tumoral do paciente.
Nosso método de avaliação de viabilidade tecidual em tempo real é bastante versátil e pode ser aplicado a estudos de biologia do câncer, neurociência e biologia do desenvolvimento. Preparar fatias de tecido viáveis em tato é a chave para o sucesso do procedimento. As configurações vibratome em composição média devem ser ajustadas de acordo com o tipo de tecido e firmeza.
No dia da aquisição da fatia de tecido tumoral, aliquot 250 microliters de cultura de fatia de tecido médio por poço em uma placa de 24 poços e colocar uma cultura de tecido inserir em cada poço. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono até o uso. Para adquirir fragmentos de tecido tumoral, submergir o tecido tumoral no HBSS gelado em uma placa de cultura de 10 centímetros e usar um bisturi para cortar o tecido ao meio.
Use um soco de biópsia de seis milímetros para adquirir cilindros do tecido tumoral e aparar uma extremidade de cada cilindro para criar uma superfície plana. Coloque os pedaços de tecido em HBSS fresco e gelado e ligue um Vibratome. Desinfete todos os equipamentos com 70% de etanol e coloque a bandeja tampão Vibratome, coberta com uma tampa de vidro acrílico, no centro do banho de gelo Vibratome.
Adicione gelo ao banho, encha a bandeja de tampão com HBSS frio. Coloque uma lâmina de barbear no suporte da lâmina e use fórceps dentados para selecionar cuidadosamente uma amostra de tumor perfurada em biópsia. Adicione uma gota de cola de cianoacrilato de grau médico na placa do espécime.
Coloque o tecido em um pedaço de papel toalha sem fiapos para remover qualquer excesso de tampão e montar o cilindro de tecido na gota em uma posição estável e vertical. Após dois a três minutos de secagem de ar, coloque a placa na bandeja de tampão e adicione HBSS adicional à bandeja até que o tecido esteja totalmente imerso no tampão. Em seguida, monte o Vibratome colocando a bandeja de gelo e o conjunto da bandeja tampão no Vibratome e travando o braço.
Ajuste a espessura de corte do Vibratome para 250 micrômetros, a amplitude para três milímetros, a velocidade de corte de 0,01 a 0,25 milímetros por segundo e o ângulo da lâmina de 15 a 21 graus. Ajuste os locais de partida e extremidade da lâmina e ajuste a altura do estágio. Execute o instrumento no modo contínuo para cortar fatias por vários ciclos até que os tecidos sejam cortados uniformemente.
Use uma transferência de ponta larga biped para transferir as fatias e uma pequena quantidade de HBSS em inserções de cultura celular individual em cada poço da placa de 24 poços previamente preparada e use uma boa transferência de ponta biped para remover qualquer excesso de tampão dos poços. Quando o final da amostra for atingido, monte um novo pedaço de tecido e obtenha fatias adicionais até que amostras suficientes tenham sido adquiridas. Em seguida, cultivar as fatias de tecido na incubadora de cultura celular por 24 a 48 horas.
Para medir a viabilidade das fatias de tecido, prepare um reagente de medição de viabilidade à base de luminescência contendo luciferase e prosubstrato em uma a mil diluições em meio de cultura de fatia de tecido fresco de acordo com as instruções do fabricante e substitua o meio em cada poço da placa de 24 poços pela mistura. Adicione 50 microliters de mistura de substrato enzimático em cada fatia de tecido e coloque a placa em um agitador orbital dentro de uma incubadora umidificada com agitação suave a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite. Na manhã seguinte, meça o sinal de luminescência em cada poço em um leitor de microplaca usando as configurações apropriadas.
Depois de determinar a viabilidade da linha de base das fatias de tecido, dissolva os medicamentos de interesse em meio de cultura de fatia de tecido para obter soluções de estoque de 10x e adicione cada solução de droga de 10x ao meio de cultura na parte inferior de cada poço de fatia de tecido. Transfira 50 microliters da droga suplementada do meio de cada poço para cada fatia de tecido e devolva as fatias para o agitador orbital durante a noite. Na manhã seguinte, transfira a placa de cultura para a incubadora de subcultura sem tremer e medir a intensidade luminescente em cada amostra de tecido no leitor de microplaca nos pontos de tempo experimentais apropriados.
A viabilidade dos tecidos tumorais tratados em cada ponto de tempo pode então ser calculada usando a equação como indicado. A viabilidade das fatias de tecido preparadas a partir de uma amostra de tumor de câncer de mama de camundongos pode ser mantida por pelo menos 21 dias com trocas médias ocasionais. O tratamento com o inibidor multikinase por quatro dias reduz a intensidade do sinal de luminescência em 100 vezes em comparação com os tecidos tumorais controlados com sulfóxido de dimetil.
O tratamento com metade da concentração do mesmo inibidor diminui a luminescência já no primeiro dia e atinge o nível mais baixo no quarto dia, permanecendo baixo para cada ponto de tempo medido subsequente. Em contraste, a intensidade luminescente do grupo de tecido tumoral controlado permanece estável ao longo dos seis dias de cultura. Além disso, o tratamento de fatias de tumor de câncer de mama de camundongos com doses em série do inibidor por quatro dias ilustra as alterações dependentes de dose na viabilidade da fatia na concentração efetiva meia máxima da droga.
Xenoenxertos derivados do paciente tratados com doxorubicina, uma droga quimioterápica padrão, também apresentam alterações dependentes de dose na viabilidade. Além disso, o teste de dezessete medicamentos pré-clínicos e clinicamente aprovados em triplicado em fatias de tecido preparadas a partir de um único xenoenxerto derivado do paciente em massa fornece uma prova de conceito de que o rastreamento de medicamentos de rendimento médio pode ser realizado em fatias tumorais com o microambiente tumoral nativo. Ao preparar as amostras de tecido tumoral, tome cuidado para minimizar o contato com as fatias de tecido para evitar danificar o tecido.
Nosso método pode ser acoplado a outras abordagens, como IHC, citometria de fluxo ou sequenciamento de células únicas, para obter informações espaciais e unicelulares dos tecidos. Nossa técnica permite testar os efeitos de múltiplas drogas de interesse em várias doses sob condições fisiológicas ao longo do tempo. Ao preparar fatias teciduais de tumores com um status de patógeno desconhecido, certifique-se de realizar todos os procedimentos em um armário de biossegurança.
