O protocolo apresentado é utilizado para triagem e análise correta de candidatos bioativos em produtos naturais para controle de biofilmes orais. Também pode ser adaptado para aplicações em outros campos de pesquisa de biofilm. Este método de triagem e análise mais amido permite remover componentes bioativos simultaneamente.
A cárie dentária é uma dieta biofilm derivada, altamente prevalente, doença crônica. Este protocolo pode ajudar a identificar produtos naturais para controlar biofilmes e, consequentemente, cárie dentária. Comece preparando o solvente de extração com uma mistura hidroalcoólica.
Você amostra concentrações entre 50 e 100 miligramas por mililitro do solvente de extração e realiza extrações assistidas de ultrassom de 15 minutos em microtubos. Repita a extração três vezes. Após cada etapa de extração, centrifufique a amostra para decapar o resíduo sólido e remover o sobrenante.
Misture os supernacantes de cada etapa de extração e filtre-os. Guarde as alíquotas para análise química e bioensações. Para fracionamento, dilui a amostra de extrato bruto para obter uma solução de 100 miligramas por mililitro, utilizando o solvente de extração inicial.
Em seguida, transfira um mililitro desta amostra para um cartucho de extração de fase sólida pré-condicionado com um grama de Absorvente, e uma capacidade de seis mililitros. Realize o fracionamento, utilizando cerca de três volumes mortos de cada LUN de extração, e colete uma fração por composição LUN. Guarde alíquotas para análise química e bioensações.
Remova o solvente sob vácuo, fluxo de nitrogênio ou liofilização, e registre o peso e o rendimento. Reconstitua a matéria seca com os melhores solventes possíveis. Calcule a concentração de solvente para a solução de estoque, utilizando a fórmula no manuscrito do texto.
Reativar a cepa microbiana de S.mutans UA 159 no ágar sanguíneo, e cultivá-lo em meio de cultura líquida. Realize uma diluição de 1 a 20 da cultura inicial usando o mesmo meio de cultura, e incuba-a até chegar à fase de crescimento do registro médio. Prepare o inóculo com uma população definida em TYEG para ensaios antimicrobais e TYE com 1%de sacarose para ensaios de biofilme.
Para atividade antimicrobísmo, defina a concentração da amostra para análise e adicione-a a uma placa de 96 poços. Inclua um conjunto de controles em cada placa, conforme descrito no manuscrito do texto. Usando TYEG, ajuste o volume para 100 microliters, inocula 100 microliters de cultura microbiana, e incubar a placa por 24 horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.
Analisar o crescimento bacteriano de acordo com a turbidez por inspeção visual dos poços. Inocular uma alíquota da diluição desejada em placas específicas de ágar em duplicatas, e incubar as placas. Após a incubação, realize a contagem de colônias.
Pesar contas de hidroxiapatita em microtubos e esterilizá-las. Em seguida, lave as contas, usando o tampão de adsorção Ab.Adicione 500 microliters de saliva nos microtubos para formar um filme salivar, e incubar a 37 graus Celsius com 24 rotações por minuto durante 40 minutos. Remova o supernatante de saliva e lave as contas três vezes com Ab para prepará-las para ensaios a jusante.
Adicione 500 microlitadores da amostra ou o controle em cada microtubo contendo contas com pellicle salivar, e incuba-os a 24 rotações por minuto e 37 graus Celsius por 30 minutos. Lave as contas três vezes com Ab.Add 500 microliters de cultura microbiana a cada microtubo, e incubar os tubos em condições semelhantes por uma hora. Em seguida, lave as células desvinculas três vezes com tampão Ab.
Resuspend cada amostra com um mililitro de tampão Ab, e centicato em sete Watts por 30 segundos. Diluir em série as alíquotas de cada suspensão, dez vezes, e emplaca-las em placas específicas de ágar. Incubar as placas por 48 horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono, e contar as colônias.
Para análise de dados, insira os dados brutos dos bioensatórios em uma planilha e calcule o registro da inibição do crescimento microbiano por cada tratamento, e a porcentagem de registro da inibição do crescimento microbiano, em comparação com o controle. Corrija a densidade óptica das leituras e calcule a porcentagem de inibição de biomassa. O perfil químico da triagem biológica para a quantidade de diterpenos do tipo Clerodane e flavonoides glicosilados em três variedades de extratos de C.sylvestris, ou seja, sylvestris, intermediários e lingua, são mostrados aqui.
Após análise dos dados brutos, quatro extratos apresentaram resposta favorável. Os dados cromatográficos desses quatro extratos mostram a presença simultânea de diterpenos do tipo Clerodane e flavonoides glicosilados. Além disso, eles incluem o mesmo bioma e variedade.
Percentual calculado de CÉLULAS planctônicas tratadas, biomassa percentual dos biofilmes tratados e por cento da UFC do biofilme tratado são mostrados aqui. Nenhum extrato bruto afetou significativamente a remoção de células S.mutans aderidas à pellicle salivar. A adesão das células S.mutans à matriz glucana foi enfraquecida por três dos extratos brutos.
Uma vez que cada espécie de planta requer métodos otimizados e específicos de análise química, a melhor fração de solvente e método analítico deve ser selecionada a partir de relatórios anteriores ou definida por design experimental. É fundamental preparar formulações com o extrato bruto e frações mais ativos e testá-las em modelos complexos para evitar o desenvolvimento de biofilmes e cavidades.
