Joseph W. Ndieyira foi apoiado pelo Conselho de Engenharia e Ciências Físicas Research (EPRSC), Centro Interdisciplinar de Pesquisa em Nanotecnologia (IRC), a Royal Society (RS) e Biano consultoria (BNC). Agradecemos, Alejandra Donoso Barrera, Dejian Zhou, Manuel Vögtli, Matthew Batchelor, Matthew A. Cooper, Torsten Strunz, Trevor Rayment e Gabriel Aeppli para discussões úteis.

1. Preparação de Cantilevers <ol><li> Usando pinças Teflon imergir número seleccionado de fichas (cada braço de suporte em cantilever medindo 500 mm de comprimento, 100 mm de largura e 0,9 mm de espessura) em uma solução recém-preparada de piranha (na proporção de 1:1 H 2 SO 4 e H 2 O 2), durante 20 min . </li><li> Após cerca de 20 minutos retirar as fichas cantilever de solução piranha e lavá-los abundantemente com água deionizada e transferir imediatamente para uma solução piranha preparada na hora. Repita o passo 1.1 acima, se os chips conter manchas de sujeira Caso contrário, prossiga para a próxima etapa. </li><li> Após uma limpeza cuidadosa em água deionizada, lavar com etanol puro e seco em cantilever sobre os chips numa placa de aquecimento a 75 ° C para remover quaisquer vestígios de água. Inspecioná-los usando um microscópio óptico para confirmar a sua limpeza. </li><li> Transfira as batatas fritas cantilever limpos para uma câmara de evaporação e bombear para baixo, visando a alcançar um vácuopressão de 10 -7 mbar. </li><li> Uma vez que a pressão de vácuo requerida é atingida, revestimento de um dos lados de cada braço de suporte com uma matriz de titânio de 2 nm a primeira actua como uma camada de adesão antes de uma camada adicional de ouro de 20 nm de espessura. Para confirmar a sua espessura, usar monitor de cristal de quartzo colocados diretamente acima da fonte de destino. </li><li> Deixe revestidos chips sensores cantilever ouro na câmara de 1-2 horas para esfriar sob vácuo antes da abertura. </li><li> Transferir as fichas recém evaporada até um recipiente de armazenagem cheio de vácuo com árgon para prevenir qualquer forma de contaminações. </li></ol> 2. Cantilever Chip funcionalização <ol><li> Em primeiro lugar, providenciar micro-tubos capilares em um estágio 2 de funcionalização de acordo com o tamanho do passo do cantilever de 250 um. </li><li> Em seguida, injectar mM soluções etanólicas tiol 2 de moléculas-alvo de superfície, isto é, mucopeptides bacterianas (D-Ala e D-Lac), e um &#39;inert &#39;alcanotiol encerra em trietileno glicol (PEG), conhecidos para resistir biomolecular adsorção. 16 Cada um dos tubos capilares devem conter um sortido moléculas de captura na superfície determinados aleatoriamente para evitar a polarização do utilizador. </li><li> Ainda incubar durante 20 min as consolas na microcapilares enchido com soluções contendo tiol capturando moléculas de superfície. Assegure-se que as soluções das moléculas de captura na superfície estão confinadas para cada sensor cantilever indivíduo para evitar ou minimizar o cruzamento de contaminações. Se este processo é utilizado corretamente, ele deve alterar sistematicamente os recém-preparados ouro cantilevers revestidos em sensores quimicamente ativos formados, permitindo SAMs de alvos mucopeptídeos bactérias a se formar em superfícies revestidas de ouro como receptores. </li></ol> 3. Preparação da solução <ol><li> Dissolver M sais de fosfato de sódio mono-e di-básicos 0,1 em água ultrapura (18,2 mohms · cm resistividade) e mistura do tó produzir um valor de 7,4 pH. </li><li> Adicionar 0,002% do PS80 para as soluções tamponadas para minimizar os efeitos de agregação causadas por interações inespecíficas de moléculas da droga para o vidro. </li><li> Diluir com drogas soluções recentemente tamponado a diferentes concentrações desejadas que permitirão o cálculo de K d. </li><li> Filtrar as soluções da droga preparadas de fresco utilizando filtros de 0,2 ^ m e sonicar durante 5 minutos à temperatura ambiente antes de purgar com árgon. </li><li> Repita o procedimento com a droga no soro tamponado com soro todo. Suavemente vortex durante 15 min, com 5 minutos adicionais para assegurar a solubilidade completa. </li></ol> 4. Superfície de detecção stress <ol><li> Coloque um chip sensor cantilever funcionalizada em uma câmara de célula de fluxo líquido. </li><li> Alinhar o ponto de laser na extremidade livre de cada um dos sensores e confirmar o alinhamento através do aquecimento a câmara de líquido para 1 ° C. Todos os oito de ouro revestidas conjuntos de sensores cantilever devem ser submetidos a compressive dobragem para baixo devido ao efeito de bimetálico causado pelas diferenças nas taxas de expansão de silício e ouro. </li><li> Após aquecimento durante cerca de 10 min, para permitir que as vigas de arrefecer durante mais 10 minutos. </li><li> Calcular a variação da flexão aos sinais de flexão máxima entre os sensores individuais em cantilever e, se o desvio-padrão relativo dos sinais de flexão é ≤ 5%, então, aceitar o alinhamento, como de outro modo desejável repetir o processo. </li><li> Em seguida, medir as freqüências de ressonância de todas as oito vigas para calcular as suas constantes de mola. Se a variação da constante entre cada sensor cantilever num chip de mola é ≤ 1%, então, aceitar o chip como tendo propriedades mecânicas consistentes contrário substituir o sensor de chip de cantilever. </li><li> Ainda, o uso de um sistema de fluidos (Modelo génios Plus) através de uma válvula de seis vias para conseguir a troca de líquido no interior da célula, enquanto o fluxo de aquisição de dados deve ser conseguido usando um modo automatizado LabViewftware. </li><li> Para monitorar o cantilever dobrar de dados, utilizar os seguintes protocolos de medição: i) ou injetar solução tampão ou soro sem droga para medição de controle com duração de 5-30 min para estabelecer uma linha de base; ii) injetar solução droga para 30-60 min; iii) injectar 10 mM de HCl para lavagem de 10-60 min para dissociar complexos fármaco ligado, iv) finalmente injectar um novo passo de lavagem utilizando uma solução tampão para a outra 5-30 min para regenerar os péptidos de superfície e restaurar o sinal de linha de base. Sempre assegurar que todos os sinais são adquiridas sob caudal de líquido constante de 30-180 ul / min e a temperatura fixa de 25 ° C num armário de temperatura controlada. </li><li> Os sinais de dobra absolutos de todos os oito vigas deve ser monitorado usando o tempo de série multiplexados método feixe óptico com um único detector sensível à posição. </li><li> Para analisar os sinais de flexão a partir de cada uma das concentrações da droga, as dobragens diferenciais resultantes são convertidas em um stres diferenciaiss entre os lados superior e inferior do braço de suporte, usando a equação de Stoney. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse é declarado

Estes resultados demonstram que os sensores de matriz em cantilever tem sensibilidade para detectar e quantificar as alterações em interacções de ligação alvo da droga, especialmente na resistência à vancomicina associada com a eliminação de uma única ligação-H do bolso de ligação da droga. Mostramos a sensibilidade de detecção nanomolar de Van, de acordo com ressonância plasmon de superfície (SPR) estudos anteriores 18,19, e revelam que o método cantilever pode detectar e quantificar diretamente as moléculas da droga no sangue em concentrações clinicamente relevantes, como rotineiramente aplicada na prática clínica. Os nossos dados sugerem que a tensão de superfície diferencial pode ser descrita por uma equação de forma de produto (1), ou seja, (i) um termo químico descrever os acontecimentos de ligação específicos da droga-alvo, e (ii) um termo que descreve a conectividade geométrica mecânica entre reagir quimicamente sites de superfície, o que implica que as interações químicas locais dissociar o mecânico mundialinterações al do cantilever. Enquanto que o termo químico, é dado pela isotérmica de adsorção de Langmuir clássica, o termo geométrica revela um mecanismo percolative das drogas-alvo superficiais induzidas por tensão alterações. O limiar crítico pc ~ 10% (Figura 5) foi necessário para detectar o cantilever flexão diferencial, mostrando que a tensão de superfície é transduzida colectivamente quando uma fracção relativamente grande da superfície é ocupada por moléculas antibióticas. Para p ≥ PC, a ligação mecânica entre os locais de superfície é gradualmente transformada quimicamente estabelecida, e as interacções repulsivas de curto alcance, tais como interacções estéricas entre os nós da rede nanomecânico dá origem a aumento da dobragem para baixo da totalidade da linha suspensa. Especula-se que o nosso modelo de percolação nanomecânico pode desempenhar um papel importante no modo de acção de glicopeptídeos antibióticos em bactérias reais. Estes resultados destacam a alta sensibilidade da tecnologia cantilever para studying modo de atuação dos antibióticos e representam uma nova ferramenta de pesquisa para o estudo de drogas para melhorar a compreensão das operações de antibióticos na escala nano para informar e permitir a descoberta de drogas poderosas para controlar os problemas de infecções superbug. Para preparar o sistema cantilever para medições reprodutíveis e sensível, abordamos um conjunto de metas no protocolo, especialmente para o carregamento da amostra na célula microfluídica e procedimentos operacionais padrão para permitir detecções nanomecânicos quantitativos. Importância da tecnologia cantilever com relação aos métodos existentes Em resumo, destacamos que, embora esta tecnologia foi proposta mais de 25 anos atrás, não encontrou o seu caminho para a clínica devido à falta de medidas cuidadosas e repetitivo sobre medicamente alvos relevantes. Aqui vamos demonstrar os procedimentos que estabelecem a relevância do uso de cantilevers nanomecânicos para investigar o mecânicoai influência de antibióticos sobre os objectivos da parede celular bacteriana e para detectar a resistência antibacteriana. Os métodos convencionais de rastreio de fármacos exigem algum tipo de marcação fluorescente ou radioactiva de uma molécula repórter para medir a ligação de um analito para o seu alvo, muitas vezes em ligação com um ensaio de ligação competitiva ou ensaios de proteína enzimática e 20. A marcação das biomoléculas não só é demorado e caro, mas o rótulo pode também interferir com a interacção molecular por obstruir o local de ligação, levando a falsos negativos. Além disso, os compostos fluorescentes são muitas vezes hidrofóbicas, que podem conduzir a ligação de fundo e falso positivos. Devido a estas limitações, existe um interesse crescente em novos técnicas rótulo livres que permitem que praticamente todo o complexo molecular para ser rastreadas com desenvolvimento mínima do ensaio. As tecnologias de superfície rótulo sem mais estabelecidas no presente são SPR e Microbalance cristal de quartzo (QCM). Em contraste com essa medida SPR thconstante dieléctrica e, de um rótulo - tecnologia cantilever livre detecta a tensão de superfície gerada por uma interacção ligando-receptor, que pode medir directamente as forças nanomecânicos gerados pela ligação de ligandos específicos a receptores da superfície. A singularidade destes sensores é a sua sensibilidade não depende de propriedades dielétricas causados ​​pela variação da massa devido à ligação como na SPR e QCM, mas sim sobre uma mudança induzida por mínimos na tensão de superfície no plano analito, tornando a tecnologia exclusivamente adequado para estudar nanomecânica as moléculas de droga em concentrações antibióticas clinicamente relevantes (3-27 uM) 17. Cantilevers são também particularmente adequados para pequenas moléculas (tais como fragmentos de ADN e os medicamentos) a detecção, sob condições fisiológicas, incluindo ambientes complexos o que é em grande parte com base na indústria farmacêutica e, por conseguinte, irá servir como uma ferramenta complementar na descoberta de drogas. Tecnologia Cantilever foram empregados com sucesso nocampos da genômica 3,5, gás sensoriamento 21, proteômica 22, e as drogas 1. Além disso, cantilevers são fabricados com tecnologia de silício de baixo custo e, devido à sua compatibilidade com os processos de microfabricação, consolas podem ser miniaturizados para melhor sensibilidade e paralelização em grandes conjuntos de sensores para múltiplas drogas composto de triagem e maiores informações ricas rendimento testes de rastreio. Melhorias da instrumentação e projeto experimental vai permitir uma grande variedade de interações a serem analisados ​​em tempo real para ajudar a avançar na busca de uma nova geração de superdrugs para resolver os problemas de infecções resistentes a múltiplas drogas. Etapas críticas dentro do protocolo O desenvolvimento de protocolos de medição robusto é fundamental para as aplicações desta tecnologia. Para conseguir medições quantitativas satisfatórios alvo da droga e para determinar a concentração mais baixa de antibiótico tboné pode ser detectado no sangue, ou tampão de soro foram tratadas, passos críticos dentro do protocolo. A primeira tarefa envolve afinação e otimização de produtos químicos de captura de superfície para melhorar a especificidade de detecção de cantilever e sensibilidade. Inegavelmente, a superfície estresse transdução é um fenômeno coletivo, exigindo uma fração relativamente grande da superfície a ser coberta para estabelecer a conectividade entre as regiões quimicamente reativos. Mostra-se que, variando a densidade de péptidos na superfície de base, um limiar crítico ~ p ≥ 10%, é determinada em que a escala de tensão de superfície em função da densidade de peptídeo e caso contrário, zero (Figura 5). É importante que as experiências foram concebidas para investigar a uniformidade da tensão ao longo das vigas de assegurar desvios máximos de sinal para medições sensíveis. Além disso, os protocolos de regeneração da superfície eficientes precisam estar no lugar, permitindo que múltiplas medições de ciclo e reduzir os custos para cada test. Embora a concepção de um receptor da superfície usando tiolada extremidade hidrofóbica, a orientação da molécula de receptor e um espaçamento entre elas é essencial para permitir a auto-montagem de empacotamento denso devido a interacções de Van-der-Waals entre as moléculas, para minimizar interacções não específicas. Além disso, as moléculas de captura deve conter um polietileno glicol (PEG) do ligador para permitir uma certa parte da matriz de detecção para ser hidrófila para evitar a inserção de moléculas de analito na solução de reagir directamente com a superfície de ouro sem revestimento. As moléculas ligantes de PEG deve agir como espaçadores para reduzir constrangimentos estéricos e, portanto, permitir que os analitos solução de interagir especificamente com os receptores de superfície para induzir mensurável mudança de tensão de superfície. O sensor de matriz cantilever tem de ser testados com pelo menos uma medição de referência no local e o sinal apresentado em tempo real a deformação diferencial, obtida subtraindo o desvio absoluto do cantilever de referência a partir do sEnsing consolas. Assim, um cantilever de referência é essencial para explicar as interações inespecíficos como as mudanças de temperatura, mudanças no índice de refração ou interações na parte de baixo não funcionalizado do cantilever. Optimização do caudal (~ 30-150 ul / min) constitui um passo crítico no âmbito do protocolo, porque garante a troca eficiente de líquidos e um transporte de massa firme suficiente de materiais da solução. O projeto de uma célula líquido deve permitir a optimização do volume (5-80 mL) para as taxas de fluxo rápido para permitir a troca de líquido perfeito para superar as limitações de transporte de massa. A taxa de fluxo é especialmente importante durante a execução de medidas cinéticas 23. Câmaras de grande volume de líquido requer altas taxas de fluxo incontroláveis ​​levando a grandes requisitos de volume de amostra, o que aumenta desnecessariamente o preço do ensaio. Anteriormente, nós usamos o fluxo de gravidade para injetar diferentes amostras para a câmara de líquido medida. Fluxo de gravidade tem a vantagem de que corças não necessita de quaisquer partes mecânicas e, por conseguinte, não introduzir ruído adicional para o sistema. No entanto, sua desvantagem é que ele só funciona de forma confiável em taxas relativamente altas de fluxo (~ 200 mL / min). Obviamente, uma taxa de fluxo mais baixa (≤ 1 ul / min) exigiria volumes limitados de amostra por unidade de tempo mas, por outro lado, faz com que as reacções muito mais lenta e, portanto, requer tempos mais longos de contacto. Além disso, o fluxo de gravidade tem uma grande variação na sua velocidade de fluxo, uma vez que depende da diferença de altura entre a entrada e a saída, que diminui à medida que as soluções de amostra são consumidos durante a experiência. Para evitar problemas de escoamento por gravidade, de uma bomba de seringa deve ser usado. A vantagem do uso de uma bomba de seringa é que permite uma taxa de fluxo constante durante um longo período de tempo, permitindo que os experimentos a ser realizado num ambiente mais controlado. Limitações do protocolo O grande desafio na obtenção de um reprodutível umadetecção biológica específico d usando cantilever sensores consiste em assegurar que as propriedades da camada receptora são bioquimicamente &quot;activa&quot; e uniforme para cada ensaio. O segredo para o sucesso experimental é um pré-tratamento cuidadoso do chip sensor com uma limpeza padronizada e protocolo imobilização com químicos vinculador para orientar as moléculas do receptor em sua conformação ativa. Em nossa configuração atual, funcionalizar matrizes cantilever usando pequenos capilares de vidro, o que pode estar sujeito a alguns inconvenientes e pode ser problemático em alguns casos. Estes capilares de vidro são abertos em ambas as extremidades e, portanto, os solventes da amostra pode evaporar facilmente. Por exemplo, se a temperatura da etapa de funcionalização não é controlada com precisão, a taxa de evaporação pode variar significativamente em diferentes momentos especialmente quando a utilização de solventes voláteis como o etanol. Há também uma possibilidade de uma pequena variação no tempo de incubação a partir de um braço de suporte para outro gendo em consideração que os líquidos de detecção têm que ser carregados consecutivamente para os capilares. O outro factor limitante na funcionalização capilar é a falta de capacidade para assegurar que consolas estão sempre inserido no capilares exactamente da mesma maneira. Além disso, por vezes, as consolas têm de ser puxado um pouco para fora dos capilares, a fim de evitar a contaminação cruzada das amostras de líquidos podem fluir para o corpo da ficha. Nós podemos resolver estes problemas através do emprego de spotters jato de tinta como um procedimento de revestimento de superfície alternativo para consolas casaco. Enquanto que permitiria o controlo exacto do revestimento da amostra, com a possibilidade de dimensionar-se para matrizes de grandes dimensões, o problema mais comum é que as pequenas gotas que são depositadas sobre as vigas pode evaporar-se dentro de segundos e requer um ambiente de humidade controlada. Portanto, o tempo de incubação não podem ser ajustados facilmente, o que pode ser desejável para algumas aplicações. A interação sutil de fatores como amostra volume, o tempo de incubação e taxa de evaporação têm impacto direto sobre a exposição das consolas à amostra funcionalização e cuidados devem ser tomados para garantir a química de superfície otimizadas para ensaios cantilever como qualquer pequena variação na densidade molecular receptor terá um grande efeito sobre o cantilever resposta. Modificações de projeto experimental (ou seja, técnicas alternativas ou materiais) Para superar o grande desafio na obtenção de procedimento de revestimento reprodutível para o desenvolvimento futuro da tecnologia cantilever, diferentes estratégias são necessárias que usaria cantilevers integrados em canais microfluídicos. A ideia é que os chips especiais cantilever deve ser concebido de modo que cada braço de suporte é colocado no seu próprio canal de linha para permitir que nos procedimentos de funcionalização situ onde os canais são endereçadas individualmente. Estas modificações de desenho experimental permitiria processo de revestimento, para ser executared num ambiente controlado e fechado em que a exposição ao solvente é precisamente controlada pelo tempo de incubação e da taxa de fluxo para a imobilização de moléculas de captura automatizada em chips de cantilever. Os mesmos canais poderia então ser utilizado para as experiências de ligação reais onde todas as vigas podem ser expostas à mesma solução de analito. Além do processo de funcionalização cantilever, o mecanismo de leitura cantilever também precisa melhorar. O método de deflexão do feixe óptico é altamente sensível e que tem sido usado com sucesso em tecnologias Atomic Force Microscopy (AFM), durante muitos anos. No entanto, para as aplicações de sensores de cantiléver autoportantes a leitura óptica tem algumas desvantagens, por exemplo, não permitir medições em líquidos opacos, tais como o sangue, o alinhamento de um conjunto de lasers pode ser demorada e fastidiosa e a configuração actual não pode diferenciar entre desvios de inclinação e vertical. Assim, o futuro desenvolvimento da cantilevtecnologia er terá que considerar os aspectos do projeto do sensor geral (por exemplo, geometrias cantilever) ea leitura cantilever para protocolos de medição robustos tanto nas áreas e ambientes de laboratório. Manalis e colegas 22 desenvolveram novos tipos de sensores de cantiléver ocas onde as consolas têm um canal microfluídico incorporado dentro do feixe, permitindo que o dispositivo seja operado de um vácuo, com factores de alta qualidade. Neste modo, actuar como microbalança consolas 22, e, por conseguinte, já não é necessário dispor de uma assimetria entre os dois lados relativamente a funcionalização, assim, as moléculas de captura podem ser ligadas covalentemente ou physisorbed directamente sobre o silício, normalmente utilizando SAM ou silanos 24. As vigas podem também ser modificadas com uma camada fina de polímero, que é, em seguida, conjugada com anticorpos para a detecção 25 bioquímicas. Solução de problemas A pró comumblema relacionado com as medições em cantilever é a introdução de bolhas de ar para dentro da célula de fluxo microfluidico. Deve ser tomado cuidado para assegurar que não há bolhas de ar sejam introduzidas na célula de líquido durante a montagem do chip. Sinal de derivação também é outro problema comum causado pelas diferenças na temperatura das amostras. As vigas devem ser equilibradas para estabilizar antes de medições são realizadas. Todos os tampões, analitos e soluções de regeneração deve ser armazenada na mesma sala, como o instrumento cantilever para permitir que todas as soluções que têm a mesma temperatura. Embora a bomba de seringa pode proporcionar taxas de fluxo muito precisos e extremamente baixo, que é geralmente associada com o ruído mecânico nas medições em cantilever. Por isso, é importante a elaboração de um simples e eficaz redutor de ruído para evitar ruídos desnecessários nos sinais de deflexão. O redutor de ruído consiste em pequeno reservatório de líquido localizado entre a bomba de seringa e a célula de líquido, o qual absorve tele o ruído mecânico da bomba. Por causa da natureza sensível do detector óptico, o sistema de medição de cantilever deve idealmente ser operados em uma configuração fechada para bloquear todas as luzes de rua de interferir com o sistema de leitura óptica. Além disso, a qualidade das camadas de detecção pode diminuir significativamente, se um grande número de passos de lavagem são realizados nas vigas que limitam a vida útil do chip do sensor. Aplicações alternativas ou futuro depois de dominar esta técnica Cantilevers SAM revestidas com terminação em amino ou grupo carboxilo podem ser usados ​​como sensores de pH. Os grupos terminais funcionais protonar ou deprotonado dependendo do pH da solução e pode gerar uma carga de superfície, que leva o braço de suporte de dobrar 24. Dado que os sensores de cantiléver pode controlar as interacções fármaco-alvo associadas com a desestabilização da parede celular de uma bactéria de vida 1,6,7, que, por conseguinte, ajudar noa pesquisa e para o desenvolvimento de uma nova geração de antibióticos para combater infecções resistentes a drogas. Em consolas futuras seriam usados ​​como microbalanças para medir a massa e as taxas de células individuais 26 de crescimento. A tecnologia de cantilever será benéfico para o estudo das respostas celulares a vários factores de crescimento ou drogas. Ele também irá oferecer uma nova ferramenta para a detecção rápida de vários biomarcadores, que tem relevância imediata em aplicações médicas e point-of-care. Dada a versatilidade, tamanho pequeno, e robustez de sensores de cantiléver, eles vão formar um monitor sensível de fatores ambientais nocivos. Eles já demonstraram a sua sensibilidade na detecção de gases tóxicos e nocivos, que podem escapar do laboratório e unidades de produção industrial no meio ambiente, tais como o ácido fluorídrico 27 ou cianeto de hidrogênio 28.

O reconhecimento de paradigma sustenta grandes áreas da biologia molecular e da medicina. Em farmacologia, por exemplo, o objectivo é que interfere com uma via patológica pela chave destinada a um participante de um processo bioquímico, tais como transglycoslyation ou transpeptidação que catalisa a reticulação dos péptidos da parede celular bacteriana. O projeto de drogas é, portanto, reduzida a definição de uma molécula apropriada para atingir um encaixe local bacteriana específica para induzir um ajuste perfeito. Um exemplo clássico emulando o sucesso desta abordagem é a vancomicina (Van), que tem como alvo a parede celular de peptidoglicano, uma característica estrutural conservado de uma bactéria. Em uma bactéria gram-positiva nascente, a matriz consiste peptidoglicano de péptidos de terminação na sequência lisina-D-alanina-D-alanina, preso através de um ligante C55 lipídicas 8-10 aqui denominados D-Ala. Esses peptídeos expostos nos precursores de peptidoglicano são fundamentais para oprotecção mecânica das células bacterianas contra as forças ambientais severas, e mais importante, não são encontrados em células humanas, tornando-os alvos ideais para medicamentos antibióticos. Van liga especificamente a extremidade C-terminal dos péptidos da parede celular bacteriana, formando um moderadamente forte Van-péptido complexo, como mostrado na Figura 1. Esta interacção entre os blocos e Van péptidos expostas as acções de transpeptidases e transglycosylases, que catalisam a reticulação das paredes das células 1, impedindo-os de forma eficaz a partir de reticulação e, por conseguinte, nanomechanically enfraquece a célula bacteriana que conduz à sua morte por ruptura 1,6, 7. O surgimento de enterococo resistente à vancomicina (VRE) é um problema de saúde crescente 11 e porque a resistência bacteriana em enterococos surge devido à mudança súbita de uma amida linkage a uma ligação éster 8, esta mudança estrutural extremamente simples na superfície da bactéria exclui uma única ligação de hidrogénio do local de encaixe Van &#39;s com uma alteração posterior da bolsa de ligao. É importante neste processo altera o pentapéptido de terminal alanina presente em Enterococcus vancomicina susceptível (VSE) a uma lisina-D-alanina-D-lactato 10,12, aqui denominado D-Lac, produzindo uma redução significativa na Van-D-Lac afinidade de ligação pela três ordens de magnitude prestação Van terapeuticamente ineficazes contra infecções enterocócicas 1, o crescimento alarmante de bactérias resistentes aos antibióticos é, portanto, impulsionando o desenvolvimento de abordagens inovadoras para acelerar e restaurar a atividade antibacteriana de agentes antibacterianos ou a descoberta de drogas mais potentes contra bactérias multirresistentes infecções. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Nossos experimentos usando cantilevers free-standing é inspirado nos sistemas, como células que aproveitar a energia química em movimento. A capacidade de os sensores de cantiléver para traduzir a energia química em movimento mecânico torna sondas originais com vantagens consideráveis ​​para controlar perturbações mecânicas dos objectivos da parede celular bacteriana em tempo real. Os sensores de cantiléver require &#39;marcas&#39; no repórter e biomoléculas são detectados rapidamente em uma reação de etapa única. Eles podem rastrear múltiplas drogas em paralelo em ambientes fisiológicos, tais como soluções tamponadas e soro todo. Além disso, a tecnologia utiliza em cantilever referenciamento situ para medições diferenciais que lhes permitam detectar especificamente as interacções fármaco-alvo e, em virtude da sua fabricação por meio de vias de processamento de semicondutor padrão, eles são passíveis de produção em massa e paralelização para o rastreio de alto rendimento de milhares de drogas por hora. Em particular vários conjuntos de sensores cantilever são ferramentas úteis para o estudo da resistência aos antibióticos à vancomicina - porque a resistência à vancomicina é, essencialmente, um problema mecânico 1,6,7. As reacções entre o alvo modelo da parede celular bacteriana e Van na solução pode ser detectada através da monitorização das alterações na tensão induzida clinicamente relevante de interacções de ligação alvo da droga. A tensão gerada a partir de reacções de superfície, que se manifesta em um sinal de flexão do cantilever é analisada visualmente por meio de sensores de iluminação com um feixe de laser. Além disso, adequando o revestimento receptivo de moléculas-alvo de superfície bacterianas em cima do sensor de cantilever, perto de um número não-limitado de analitos (Van), as interações bioquímicas específicas e biomecânica do modelo matriz da parede celular bacteriana é monitorado em tempo real. Além do evento de reconhecimento molecular, existem vários factores que podem causar sensores de cantiléver para deflect, que incluem: - as variações de temperatura, a ligação não específicos ou alterações de índice de refracção da solução. Para ter em conta os sinais não específicos, em medições diferenciais são realizadas in situ, onde a dobragem de ambas as consolas de medição e de referência são monitorados continuamente para analisar interacções específicas. Além disso, a sensibilidade de detecção dos sensores de cantiléver que dependem dos química de superfície e geometria pode ser melhorada por meio do ajuste da densidade superficial de p (em que p é definido como a relação da área da superfície ocupada por moléculas de captura a toda a área de superfície superior do cantilever coberta pela população total de moléculas tal como determinado por fotoelectrão de raios-X de espectroscopia (XPS) 1. Aqui este protocolo detalhes como a vancomicina ou qualquer outro antibiótico ligação a parede celular análogos precursoras bacterianas (mucopeptides) em concentrações clinicamente relevantes na solução tamponada asoro sanguíneo nd pode ser detectada usando cantilever tecnologia sem-marcação. Superfícies de ouro frescas são usadas porque monocamadas auto-organizadas (SAMs) tendem a formar facilmente camadas estáveis ​​em 13,14 limpo ouro. SAM tipicamente consiste de moléculas pequenas com uma porção tiol ligados covalentemente na superfície de ouro, enquanto a unidade de captura desejado, na outra extremidade é deixada livre para interagir com as metas de analitos em solução. Tióis formar um sistema flexível, em particular tendo em conta que muitos compostos tiol com diferentes grupos terminais químicas estão comercialmente disponíveis ou são facilmente sintetizados num laboratório. No entanto, deve ser tomado cuidado para assegurar que as moléculas com uma porção tiol deve ter os grupos finais correctas, por exemplo, numa proteína ou péptido de conjugação, o grupo amino deve estar virada para dentro, para a reacção com o grupo carboxílico do radical tiol amarrado no à tona a ocorrer. Aqui, os tióis foram diretamente conjugado com miméticos tripeptídeo de bactérias lipídico II do bparede celular acterial objectivos sintetizados por metodologia de fase sólida, utilizando comercialmente disponível Wang pré-D-Ala e resinas de Wang-D-Lac eo padrão Fmoc grupo protector de química 15. Embora esta descrição é voltado para vancomicina, claramente ele pode ser estendido a outros antibióticos e de fato mais estudos são convidados por pesquisadores de diferentes áreas particularmente em bioquímica, farmacologia e ciência dos materiais a adotar facilmente este protocolo para seus próprios experimentos.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Items</td>
			<td>Catalog Number </td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scentris</td>
			<td></td>
			<td>Scentris, Veeco Instruments, Inc</td>
			<td>Not in production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-way valve</td>
			<td></td>
			<td>MVP, Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>Enables multiple concentration injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB Evaporator</td>
			<td></td>
			<td>BOC Edwards Auto 500, UK</td>
			<td>Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage vessel</td>
			<td></td>
			<td>Agar Scientific, UK</td>
			<td>Keeps gold coated films fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td></td>
			<td>King Precision Glass, Claremont, CA, USA</td>
			<td>For capillary functionalization of the cantilever arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump</td>
			<td></td>
			<td>Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA</td>
			<td>Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-4.5 &#956;m Filters</td>
			<td>1511940001</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>For sample filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever chips</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Highly sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td>Millipore Co., Billerica, MA, USA</td>
			<td>Used for making solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole serum</td>
			<td>GEM-700-110-H</td>
			<td>Sera Laboratories International Ltd, UK</td>
			<td>Used in measurements that mimic physiological conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin (Van)</td>
			<td>1404-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Drug used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>7664-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Ala and D-Lac</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td></td>
			<td>National Instruments Co., Austin, TX, USA</td>
			<td>Software used for instrumental interface to allow controlled measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomechanics of drug-target interactions and antibacterial resistance detection

O sensor de cantilever, o qual actua como um transdutor de reacções entre o modelo de matriz da parede celular bacteriana imobilizadas na sua superfície e antibióticos em solução, tem mostrado um considerável potencial em aplicações bioquímicas detecção com sensibilidade e especificidade sem precedentes 1-5. As interacções fármaco-alvo gerar tensão de superfície, fazendo com que o braço de suporte para dobrar, e o sinal pode ser analisado opticamente quando é iluminada por um laser. A mudança na tensão de superfície medidos com precisão nano-escala permite que as interrupções de biomecânica da parede celular bacteriana modelo tem como alvo a ser rastreado em tempo real. Apesar de oferecer vantagens consideráveis, vários conjuntos de sensores cantilever nunca foi aplicado na quantificação de interações de ligação droga-alvo. Aqui, um relatório sobre o uso de silicone várias matrizes cantilever revestido com alcanotiol monocamadas auto-organizadas que imitam bacteriana matriz da parede celular para estu quantitativamentedy interações de ligação de antibióticos. Para compreender o impacto da vancomicina sobre a mecânica de estruturas da parede celular bacteriana 1,6,7. Foi desenvolvido um novo modelo de um braço de suporte, que propõe que a flexão pode ser descrita por dois factores independentes; i), nomeadamente um elemento químico, que é dado por uma isotérmica de adsorção de Langmuir clássica, a partir da qual podemos calcular a constante de dissociação de equilíbrio termodinâmico (K d) e ii) um factor geométrico, essencialmente uma medida da quantidade de péptidos receptores bacterianos são distribuídas na superfície do braço de suporte. A distribuição superficial dos receptores de peptídeos (p) é utilizado para investigar a dependência da geometria e do ligando de carregamento. Mostra-se que um valor de limiar de p ~ 10% não é crítico para aplicações de detecção. Abaixo do qual não é detectado nenhum sinal de flexão enquanto que acima deste valor, o sinal de ruptura aumenta quase linearmente, revelando que o stress é um produto químico de um local de ligação de factor e um fator geométrico combinado pela conectividade mecânica das regiões reagiram e fornece um novo paradigma para a concepção de agentes poderosos para combater infecções superbug.

A mudança de tensão medida com precisão de nano-escala, com uma sensibilidade sem precedentes para um único exclusão H-bond, é explorada para acompanhar os rompimentos do modelo bacterianas biomecânica da parede celular em tempo real (Figuras 2a-d). O limite de sensibilidade para a detecção de drogas de Van foi investigada por diluição seriada suas concentrações em passos de 1,000 uM a 10 nM ≤, revelando 10 nM (~ 15 ng / ml) como a concentração mínima detectável dando origem a uma média de -9 ± ~ 2 nm como os sinais de flexão diferencial (Figura 2c). A capacidade para detectar antibióticos sob ambiente fisiológico, foi investigada no soro numa gama de concentrações clinicamente relevantes de 3-27 fiM 17. Após a injecção de 7 uM Van no soro (soro fetal de vitelo 90% e 10% de tampão fosfato de sódio pH 7,4) em todas as vigas e em condições idênticas, o sinal diferencial paraDAla sérico era 105 ± 4 nm, enquanto que para DLac cantiléveres revestidos, foi observada nenhuma dobra (Figura 3). Os sinais de flexão consideráveis ​​observados para revestido DAla (vancomicina susceptível) consolas são causadas pelas fortes interacções de ligação alvo da droga. No entanto, para revestido DLac (resistentes à vancomicina) cantilevers, a presença de repulsão do estado fundamental do par solitário de oxigênio ea reduzida NH vínculo no vancomicina bolso ligação 10,12 contribui para o enfraquecimento das interações de ligação droga-alvo que resulta em menor ou nenhuma cantilever flexão, particularmente para concentrações de vancomicina inferiores (Figura 3). No entanto, para uma elevada concentração de vancomicina, observamos sinais mensuráveis ​​para DLac flexão. Além disso, nosso projeto experimental é importante para a referenciação situ onde todos cantilevers revestidas com ambos e DAla DLac exposto simultaneamente a mesma substância a analisar, em tempo real. Para entender o papel preciso da química e geometria, foi elaborado um modelo de uma descrevendo a correlação entre as interações solvente e mecânicos de superfície. Isso produz a tensão de superfície: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" /> para p&gt; pc e zero caso contrário (1) O primeiro termo da equação (1) é a isotérmica de adsorção de Langmuir, sendo responsável por eventos de ligação droga-alvo eo segundo termo é a forma de lei de potência que descreve as conseqüências mecânicas de grande escala de formação de rede estressado. A constante corresponde a uma tensão máxima de superfície, quando todos os sítios de ligação estão ocupados acessíveis e K, d é a superfície de equilíbrio de dissociação contrasTant no cantilever. A análise, conforme mostrado na Figura 4 é o resultado do ajuste global de equação (1), sobreposto sobre os sinais de tensão diferencial medida que revelem, a ~ 29,7 ± 1,0 ou 14,1 ± 3,0 mN / m e K ~ d 1,0 ± 0,3 800 ± 310 ou iM para D-Ala ou DLac péptidos, em que A corresponde a uma medida da tensão de superfície, quando todos os sítios de ligação estão ocupados acessíveis. A maior sensibilidade do braço de suporte foi afinado por densidades variando sistematicamente o péptido p, enquanto os dados de controlo de esforço em função do p, enquanto as concentrações de antibióticos fixada em 10, 100 e 250 uM, respectivamente (Figura 5). O processo foi repetido com o stress como uma função das concentrações de Van enquanto as densidades de péptidos fixado em p ~ 100%. &lt;img alt = &quot;Figura 1&quot; fo: content-width = src &quot;5 polegadas&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Detecção de antibióticos cantilever superfície interacções de ligação. a) Representação esquemática de uma matriz de sensores cantilever e o modo pelo qual as interacções fármaco-alvo são detectados nanomechanically. b) interacção de ligação química entre uma molécula de fármaco (Van) e o análogo mucopeptídeos bacteriana (D-Ala ou D-Lac). c) O mecanismo pelo qual a mutação bactérias sensíveis à vancomicina (VSE) adquire resistência à vancomicina pela exclusão de um H-bond único no bolso vinculativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" /&gt; Figura 2. Seguir os rompimentos do modelo bacterianas biomecânica da parede celular em tempo real. a) Os sinais de flexão absolutos de D-Ala, D-Lac e PEG cantiléveres revestidas em tampão fosfato de vancomicina e 250 uM. Os sinais de referência de PEG diferenciais são mostrados em linhas pretas. B) sinais de flexão diferenciais de D-Ala e D-Lac cantiléveres revestidas em tampão fosfato 250 mM e vancomicina. C) O braço de suporte de deflexão diferencial de um sinal dependente da dose, como uma função de tempo na presença de concentrações de vancomicina na ordem de 10 nM (linha amarela), 100 nM (linha vermelha) e 1000 nM (linha vermelho escuro), respectivamente. d) Os sinais de deflexão em cantilever diferenciais para as três D-Ala sensores de cantiléver revestidos como um função do tempo, na presença de 10vancomicina nM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" /> Figura 3. Rastreamento das interrupções do modelo bacterianas biomecânica da parede celular em tempo real para um D-Ala e D-Lac cantilevers revestidos na presença de 7 mM vancomicina em soro fetal bovino. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" /> Figura 4. Investigando os nanomecânica de interações droga-alvo. Plot mostrando a resposta ao estresse superfície diferencial medida para D-Ala (círculos pretos) e D-Lac (círculos vermelhos) cantilevers revestidos em função da vancomicinaconcentração em solução [Van]. Os dados são descritos pela equação (1) (linhas sólidas) 1. <img alt="Figura 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" /> Figura 5. Optimização da sensibilidade de detecção de nanomecânico de interacções receptor-ligando por investigar a dependência da carga e da geometria do receptor através de monocamadas mistas. De medição de tensão de superfície respostas diferenciais de sensores de cantiléver como uma função de D-Ala cobertura de superfície, p, na presença de concentrações fixas de vancomicina solução a 10 mM (linha preta), 100 mm (linha vermelha) e 250 mM (linha verde).

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Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

Resistência adquirida aos antibióticos é um grande problema de saúde pública e é atualmente classificada pela OMS como uma das maiores ameaças à vida humana. Aqui descrevemos o uso da tecnologia do cantilever para quantificar a resistência antibacteriana, fundamental para a descoberta de novos agentes e poderosa contra bactérias resistentes a múltiplas drogas.

Nanomecânica de interações medicamentosas-alvo e de detecção de resistência antibacteriana

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

nanomechanics-drug-target-interactions-antibacterial-resistance

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.1K visualizações.  University College London. Resistência adquirida aos antibióticos é um grande problema de saúde pública e é atualmente classificada pela OMS como uma das maiores ameaças à vida humana. Aqui descrevemos o uso da tecnologia do cantilever para quantificar a resistência antibacteriana, fundamental para a descoberta de novos agentes e poderosa contra bactérias resistentes a múltiplas drogas.

Vídeo: Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Imunologia e Infecção

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Amplificar e Quantificação do HIV-1 RNA no indivíduos infectados pelo HIV com carga viral abaixo do limite de detecção pela Standard Ensaios Clínicos

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

Um dia-Esquema de fluxo de trabalho para detecção de patógenos de bactérias e de resistência antimicrobiana de hemoculturas

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Triagem rápida de HIV transcriptase reversa e integrase Inibidores

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

Um Modelo Pneumonia robusta em imunocompetentes Roedores para avaliar antibacteriano Eficácia contra<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ou<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this challenge, dereplication, which is the process of identifying known compounds, is performed on samples of interest. Methods for dereplication such as analytical separation followed by mass spectrometry are time-consuming and resource-intensive. To improve the dereplication process, we have developed the antibiotic resistance platform (ARP). The ARP is a library of approximately 100 antibiotic resistance genes that have been individually cloned into Escherichia coli. This strain collection has many applications, including a cost-effective and facile method for antibiotic dereplication. The process involves the fermentation of antibiotic-producing microbes on the surface of rectangular Petri dishes containing solid medium, thereby allowing for the secretion and diffusion of secondary metabolites through the medium. After a 6 day fermentation period, the microbial biomass is removed, and a thin agar-overlay is added to the Petri dish to create a smooth surface and enable the growth of the E. coli indicator strains. Our collection of ARP strains is then pinned onto the surface of the antibiotic-containing Petri dish. The plate is next incubated overnight to allow for E. coli growth on the surface of the overlay. Only strains containing resistance to a specific antibiotic (or class) grow on this surface enabling rapid identification of the produced compound. This method has been successfully used for the identification of producers of known antibiotics and as a means to identify those producing novel compounds.

We describe a platform that utilizes a library of isogenic antibiotic resistant Escherichia coli for the dereplication of antibiotics. The identity of an antibiotic produced by bacteria or fungi can be deduced by the growth of E. coli expressing its respective resistance gene. This platform is economically effective and time-efficient.

Desreferência antibiótica usando a plataforma de resistência a antibióticos

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...