Este protocolo fornece uma referência confiável para a preparação de uma suspensão de célula única de alta qualidade do intestino da tilápia do Nilo para facilitar estudos em nível de célula única em espécies de peixes de aquicultura. A tecnologia é altamente eficiente e pode ser implementada na maioria das condições de laboratório. Reduz a necessidade de ensaios adicionais para preparar suspensões unicelulares para espécies de peixes de aquicultura.
Comece enxaguando peixes de tilápia do Nilo de seis meses de idade em água estéril bem aerada por 15 minutos para lavar as bactérias soltas da superfície. Para preparar o reagente de dissociação enzimática celular, diluir a colagenase dispase em PBS até uma concentração final de um miligrama por mililitro. Misturar 95% do volume da solução enzimática preparada e 5% do volume de FBS.
Em seguida, pré-resfriou a centrífuga a quatro graus Celsius antes de usar. Para a dissecção do tecido, colocar os peixes eutanasiados no gelo e coletar de três a quatro centímetros da seção média dos intestinos. Excique a gordura e o mesentério usando fórceps.
Remova a gordura aderida à superfície intestinal e a mucosa clara elástica e maleável. Lave suavemente o fragmento do intestino com PBS gelado estéril usando uma seringa para lavar o conteúdo intestinal e o muco. Após várias lavagens, disseque o fragmento em pequenos pedaços e transfira-os para um tubo de 1,5 mililitro contendo um mililitro de PBS gelado.
Centrifugar a mistura a 300 x g em quatro graus Celsius durante cinco minutos. E substitua o sobrenadante por um mililitro de 0,08% BSA-DPBS gelado. Usando uma pipeta de vidro aspirar suavemente para ressuspender os fragmentos de tecido.
Depois de lavar as peças mais uma vez, retire o sobrenadante e adicione um mililitro do reagente de dissociação enzimática preparado. Misturar também cinco microlitros de inibidor de RNAs com o reagente de dissociação para sequenciamento de RNA de célula única. Coloque o tubo em banho-maria temperado a 37 graus Celsius e inverta manualmente o tubo a cada cinco minutos durante o tempo de incubação de 30 a 60 minutos.
Uma vez que os tubos são girados, remova o reagente de dissociação enzimática da célula usando pontas largas. Adicione um mililitro de 0,08% BSA-DPBS gelado e pipete suavemente as células para cima e para baixo para evitar a ruptura celular. Após a centrifusão e ressuspensão das células mais uma vez, coloque o filtro de células de 40 micrômetros pré-molhado com 0,08% de BSA-DPBS em um tubo cônico de 50 mililitros.
Passe a suspensão da célula através do filtro. Bata no coador, depois enxágue-o com 200 microlitros DPBS e recolha a suspensão no fundo do tubo. Depois de transferir a suspensão para um tubo de 1,5 mililitro, adicione cinco microlitros de DNA e incube a suspensão por 15 minutos a 15 a 20 graus Celsius.
Uma vez centrifugado, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 400 microlitros de DPBS gelada sem íons cálcio e magnésio. Em seguida, pipetar suavemente para cima e para baixo com pontas largas para misturar as células e repetir esse processo mais uma vez. Para a coloração, misturar a suspensão celular em solução de azul de tripano a 0,4% em igual proporção e incubar por três minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, adicione 10 microlitros da mistura na lâmina de vidro. Contar as células viáveis e mortas ao microscópio em três campos e calcular a porcentagem de viabilidade celular. As eficiências de dissociação de várias enzimas comumente utilizadas foram comparadas.
Verificou-se que a mistura de colagenase dispase tem um melhor efeito de dissociação do que a colagenase dispase ou tripsina isoladamente e várias outras misturas enzimáticas. O exame microscópico mostrou que as células intestinais tinham alta viabilidade e dispersas como células únicas. A maioria das células era viável, enquanto algumas foram coradas mortas devido à permeablização da membrana celular.
Preste atenção ao tipo de PBS usado. A solução de digestão enzimática não pode ser usada com PBS livre de cálcio/magnésio, pois a enzima requer íons cálcio/magnésio para funcionar de forma eficaz. O procedimento facilita estudos em nível de célula única em espécies de peixes de aquicultura, fornecendo uma referência valiosa para o desenvolvimento de protocolos de dissociação celular de espécies de peixes de aquicultura.
