Preparar uma única suspensão de células ou núcleos únicos é um passo crítico para transcrição de alta taxa de rendimento e perfil de epigenome. Nosso protocolo fornece um método simples, reprodutível e universal para o isolamento de núcleos únicos. Ao contrário de outros métodos que requerem detergente para isolamento de núcleos, nosso protocolo é baseado em colunas, que é livre de detergente e enzimas.
Permite o isolamento dos núcleos em menos de 30 minutos. Nosso protocolo simplifica o isolamento dos núcleos. Fornece um método robusto para preparar a suspensão de núcleos únicos de tecidos difíceis de dissociar.
Para começar, o tampão pré-frio A e B de um kit de isolamento de núcleos sem detergente, colocando-os no gelo por pelo menos 30 minutos. Reveste tubos e pontas de pipeta com solução 5%BSA, o que aumentará a recuperação dos núcleos. Para revestir as pontas da pipeta, pipeta solução 5%BSA duas a três vezes e secá-las por duas horas.
Para revestir os tubos, enchê-los com BSA e inverí-los três vezes. Remova a solução e seque os tubos de cabeça para baixo em um papel de tecido limpo por duas horas. Cubra um tubo de coleta e um tubo de 1,5 mililitro por amostra.
Use fórceps para quebrar suavemente o crânio e remover tecidos moles, pele e ossos dos lados ventral e dorsal do crânio. Em seguida, transfira suavemente o cérebro para um prato de 30 milímetros contendo PBS gelado e pica o cérebro em pequenos pedaços usando uma lâmina de barbear. Para isolar núcleos únicos, transfira o tecido picado para o cartucho de filtro fornecido no kit de isolamento dos núcleos e remova a solução em excesso e adicione 200 microliters de tampão frio A.Triture o tecido com uma haste plástica por dois minutos.
Adicione 300 microliters de tampão frio A ao cartucho do filtro e incuba-o no gelo com a tampa aberta por 10 minutos. Em seguida, tampe o cartucho e resuspende o tecido invertendo o tubo cinco vezes. Centrifugar o tubo de amostra a 16.000 vezes g durante 30 segundos para romper as células.
O fluxo contém núcleos intactos, que formam uma pelota incolor na parte inferior do tubo. Descarte o filtro e, em seguida, resuspenque a pelota vórtice vigorosamente por 10 segundos. Pellet os núcleos novamente, centrifugando a solução a 500 vezes g por três minutos.
Em seguida, descarte cuidadosamente o supernaspe. Resuspengue a pelota em 0,8 mililitros de tampão frio B por pipetar duas a três vezes e centrifugar os núcleos a 600 vezes g por 10 minutos, o que os separará dos detritos da membrana. Descarte cuidadosamente o supernaspe.
Resuspenja os núcleos isolados em 500 microliters de PBS com 5%BSA e mantenha a suspensão no gelo até o FACS. Para confirmar a morfologia nuclear com a coloração HEX, transfira 100 microliters da suspensão de núcleos únicos para um novo tubo usando as pontas revestidas de BSA. Manche os núcleos adicionando 0,1 microliter de HEX e suavemente vórtice do tubo.
Transfira a suspensão dos núcleos para uma placa de fundo de vidro e imagem dos núcleos usando um microscópio de fluorescência com uma configuração de excitação a laser de 405 nanômetros. Antes de realizar o FACS, filtre os núcleos com um coador de células de 40 micrômetros em um tubo revestido de BSA. Diluir a suspensão filtrada adicionando PBS com 5%BSA a um volume final de 1.000 microliters.
Rotule dois tubos FACS de fundo redondo como controle e manchados e transfira 250 microliters da suspensão dos núcleos para o tubo de controle usando uma ponta de pipeta revestida BSA. Transfira os 750 microliters restantes da solução para o tubo FACS rotulado manchado e adicione um microliter de corante HEX para manchar os núcleos. Em seguida, misture-o por vórtice lento.
Carregue a amostra de controle não manchada no classificador de células e grave 5.000 eventos. Em seguida, carregue a amostra manchada e grave 5.000 eventos. Desenhe portões FACS para identificação de núcleos únicos.
Os núcleos podem ser selecionados comparando o sinal fluorescente HEX entre o controle e amostras manchadas. Em seguida, classifique núcleos positivos HEX do tubo manchado em um novo tubo de 1,5 mililitro contendo 50 microliters de PBS com 5%BSA. Este protocolo foi usado para gerar suspensão de núcleo único diretamente do tecido cerebral de zebrafish.
Os núcleos isolados foram manchados com HEX e visualizados com microscopia de fluorescência. Eles pareciam intactos, redondos e bem separados. Importante, a agregação nuclear estava ausente.
O enriquecimento de núcleos isolados foi realizado com citometria de fluxo, gating na presença de um sinal fluorescente HEX. Núcleos não manchados exibiam fluorescência de fundo enquanto núcleos manchados apresentavam forte sinal de fluorescência. Os núcleos manchados e manchados estavam bem segregados no canal violeta.
Ao tentar este protocolo, é importante lembrar que núcleos únicos tendem a grudar em um material plástico. Para evitar a perda potencial de núcleos e aumentar a eficiência, o revestimento básico do material plástico é altamente recomendado. Suspensão isolada de núcleos únicos pode ser utilizada para núcleos únicos RNA Esta técnica elucida a heterogeneidade celular em sistemas biológicos complexos e ajuda a definir subtipos celulares e redes genéticas.
O uso de um método sem detergente e enzima registra o ruído técnico e o viés introduzidos durante a preparação da amostra. Este método desenvolveu um isolamento único simplificado e logístico.
