Este é o primeiro protocolo otimizado para isolar núcleos de alta qualidade para experimentos de sequenciamento de núcleos únicos usando cérebros congelados de killifish turquesa africano, um modelo emergente de vertebrados para pesquisa de envelhecimento. Este protocolo isola núcleos muito suavemente, o que o distingue de protocolos mais severos otimizados para outros organismos com cérebros mais mielinizados, o que resulta em núcleos degradados quando usados no killifish. Este método será fundamental para nos ajudar a entender o envelhecimento cerebral em um nível de célula única.
Deve traduzir-se bem para outros tecidos que requerem um isolamento mais suave dos núcleos. Este protocolo é fácil de usar. A tarefa mais exigente é a centrifugação de gradiente para remoção de detritos, na qual é melhor ser lento e exato do que rápido e confuso.
Demonstrando o procedimento estarão Ari Adler e Brian Teefy, um técnico de laboratório de pesquisa e um pós-doutorado do laboratório de Benayoun. Depois de dissecar o killifish, descongele o tecido cerebral congelado no gelo por 10 minutos e salte o cérebro em um mililitro de tampão de lise de núcleos gelados em um homogeneizador de rejeição de dois mililitros. Ao lisar a amostra, mantenha o homogeneizador no gelo e evite gerar bolhas.
Jogue o tecido conforme descrito no manuscrito e deixe a amostra descansar sobre o gelo no homogeneizador de rejeição por dois minutos. Em seguida, coe a amostra através de um filtro de células de 70 micrômetros em um tubo cônico de 15 mililitros pré-revestido com 5% BSA. Adicione quatro mililitros de tampão de lavagem de núcleos à amostra pipetando o tampão de lavagem sobre o filtro de células de 70 micrômetros e misture invertendo suavemente o tubo cinco vezes.
Usando um rotor de caçamba oscilante, centrifugar a amostra a 500 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante despejando-o suavemente em um recipiente de resíduos líquidos. Mantenha a amostra ereta e remova o tampão de lavagem restante usando uma pipeta P1000.
Ressuspeite imediatamente os núcleos em um mililitro de tampão de lavagem de núcleos com uma ponta de pipeta P1000 de furo largo. Em seguida, traga a amostra para cinco mililitros, adicionando quatro mililitros de tampão de lavagem de núcleos e misture como demonstrado anteriormente. Pellet a célula por centrifugação.
Descarte o sobrenadante e ressuspenda os núcleos em um mililitro de tampão de lavagem de núcleos com uma ponta de pipeta de furo largo. Agora, transfira os núcleos para um tubo de citometria de fluxo. Adicione 300 microlitros de solução de remoção de detritos à suspensão celular e misture-a completamente pipetando com uma ponta larga até que a mistura fique homogênea.
Segure o tubo em um leve ângulo e sobreponha suavemente um mililitro de tampão de lavagem de núcleos em cima da solução de núcleos usando uma pipeta P1000. Centrifugar a amostra em um rotor de caçamba oscilante a 3000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte completamente as duas fases superiores usando uma pipeta P1000.
Transfira a camada inferior para um tubo cônico de 15 mililitros pré-revestido com 5% BSA. Em seguida, traga o volume para 15 mililitros com tampão de lavagem de núcleos e misture invertendo o tubo três vezes. Centrifugar o tubo a 1000G por 10 minutos a quatro graus Celsius em um rotor de balde oscilante.
Remova o sobrenadante com cuidado e ressuscite imediatamente o pellet em 150 microlitros de tampão de lavagem de núcleos usando uma ponta de pipeta de furo largo. Mude para uma ponta de pipeta de furo padrão ajustada para 300 microlitros. Pipete toda a amostra e, em seguida, prenda um filtro de 40 micrômetros na ponta na extremidade da ponta da pipeta.
Filtrar a amostra expelindo-a com força através do filtro para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros de ligação ao ADN. Em um tubo FACS, ressuscite 10 microlitros da amostra de núcleos filtrados em 90 microlitros do tampão de citometria de fluxo recomendado. Coloração das amostras com iodeto de propídio a uma concentração final de um micrograma por mililitro.
Depois de configurar o espaço de trabalho conforme descrito no manuscrito, inicie o fluxo pressionando o ícone de reprodução no canto inferior direito. Verifique se há bolhas de ar ou aglomerados na amostra usando a área de dispersão lateral versus HDRT. Além disso, verifique o gráfico de dispersão lateral versus dispersão para frente para verificar se os eventos estão se acumulando dentro dos limites da janela.
Para uma exibição ampliada, clique duas vezes na área de dispersão lateral versus gráfico PerCP-Vio700-A. Clique no botão na barra de ferramentas superior esquerda com uma linha perpendicular para selecionar uma porta de quadrante. Em seguida, clique em qualquer lugar na área de dispersão lateral versus gráfico PerCP-Vio700-A e os quadrantes aparecerão dentro do gráfico.
Clique em qualquer lugar nas linhas divisórias do quadrante e deslize o cursor para modificar o posicionamento do quadrante. Coloque os quadrantes de tal forma que o quadrante superior esquerdo contenha detritos e o quadrante superior direito contenha núcleos. Clique no ícone quadrado, cinza, I para abrir a janela de propriedades.
Vá para a guia de funções de região e verifique uma marca de seleção verde ao lado do item superior, indicando que todo o gráfico está selecionado. Na lista de funções, clique em contar por microlitro para produzir uma marca de seleção verde. Clique em OK e cada quadrante exibirá uma métrica de contagem por microlitro.
Selecione contagem e porcentagem total na guia de funções de região para exibir contagens brutas e porcentagens, se desejado. Desenhe um portão poligonal em torno dessa população clicando no botão de polígono na barra de ferramentas superior esquerda. Em seguida, clique uma única vez e deslize o mouse para desenhar um segmento linear do portão.
Clique novamente para concluir e começar o próximo, seguido por um clique duplo para terminar o portão. Clique na borda do portão e deslize o mouse para reposicioná-lo. Clique nos vértices do portão para modificar a forma, e as contagens por microlitro da população fechada aparecerão.
Núcleos saudáveis que apareceram como núcleos singletos com membranas intactas são adequados para análise a jusante. No entanto, núcleos insalubres são caracterizados por membranas nucleares danificadas, o que leva à aglomeração de núcleos e pode contribuir para sinais de fundo em aplicações a jusante. Os núcleos estão em formas singletas e múltiplas no quadrante superior direito, com singlets como a menor nuvem de eventos, seguida por duplos e trigêmeos em ordem crescente.
Os detritos são marcados por eventos nos dois quadrantes mais à esquerda em uma preparação de núcleos de baixa qualidade, onde a etapa de remoção de detritos foi omitida. Os detritos representam mais de 40% dos eventos. No entanto, em um experimento de alta qualidade, os detritos representam menos de 15% de todos os eventos.
É imperativo remover completamente a camada intermediária após a etapa de centrifugação de remoção de detritos para reduzir a contaminação de RNA de fundo Os núcleos isolados usando este protocolo podem ser usados para sequenciamento de RNA de núcleos únicos ou sequenciamento ATAC para obter informações transcriptômicas e epigenéticas de nível de célula única. Esta técnica permitirá que os pesquisadores explorem a regulação gênica do cérebro no nível de célula única no killifish turquesa africano, um organismo modelo de vertebrado de vida naturalmente curta para pesquisa de envelhecimento.
