Bissulfito de conversão de protocolo Um protocolo padrão para a conversão de 2 microgramas de DNA genômico é descrito abaixo. Quantidades maiores ou menores do DNA genômico (100 pg-200 mg) também pode ser tratada com sucesso bissulfito. Estas condições de reação resultar em conversão completa (99,5-99,7%) de quase todas as seqüências de DNA alvo 3. 1. Preparação DNA Preparação de amostras, incubando DNA genômico com tampão de bissulfito de DNA de Lise (2 mg t RNA, 280 ng / mL de Proteinase K, SDS 1%) em um volume total de 18 mL para 1 hr a 37 ° C. Nota: Isto é importante para alcançar conversão de bissulfito máxima, especialmente com DNA isolado de amostras clínicas, onde ainda pode haver proteína associada com o DNA. 2. DNA Desnaturação <ol><li> Desnaturar DNA mg 2 em um volume de 20 l, adicionando 2 l da recém-preparados 3M NaOH para um final de cONCENTRAÇÃO de 0.3M. </li><li> Incubar as amostras a 37 ° C por 15 min em banho-maria, seguido de incubação a 90 ° C por 2 min em um bloco de calor. Colocar imediatamente os tubos em gelo durante 5 min. </li><li> Centrifugar os tubos a 4 ° C por 10 s em 10.000 g, para garantir o DNA está no fundo do tubo. </li></ol> 3. Desaminação bissulfito Sulfonação e desaminação hidrolítica <ol><li> Preparar soluções fresco de 10 mM quinol e saturado de sódio metabissulfito de pH 5,0 (7,6 g Na 2 S 2 O 5 com 464 mL de NaOH 10 M, feita até 15 ml com água). A solução de bissulfito de sódio saturada é obtida invertendo suavemente o reagente / H mistura O 2, com mínimo de mistura e aeração. Se necessário, ajustar o pH com NaOH 10 M, para a dissolução total da Nota de metabissulfito de:. Como é uma solução saturada, pequenos caroços ainda pode permanecer não dissolvida. </li><li> Adicionar 208mL do metabissulfito de saturada e 12 mL de quinol 10mM para o DNA desnaturado (20 l), em um volume final de 240 mL para uma concentração final de 2.31M bisulphite/0.5mM quinol, pH 5.0. Misture suavemente todos os reagentes e centrifugar por 10 segundos para garantir a todos as gotas são na parte inferior do tubo. </li><li> Sobreposição das amostras, com 200 mL de óleo mineral. Incubar as amostras a 55 ° C em banho-maria, por 4-16 horas. A duração do tratamento bissulfito é dependente da quantidade e qualidade do DNA a ser convertido. Para o DNA de má qualidade ou DNA degradado, limitar o tempo de incubação a 4 horas. Nota: é importante que que a conversão de bissulfito ocorre no escuro para evitar a oxidação, por isso, se isso não é possível envolver os tubos em alumínio antes da incubação . </li><li> No final do tempo de incubação apropriado, spin os tubos brevemente em uma microcentrífuga para garantir todo o líquido está no fundo do tubo. </li><li> Recuperar o DNA de bissulfito de tratadosdebaixo da camada de óleo com cuidado pipetagem fora da solução de DNA a partir do fundo do tubo, sem ocupar qualquer um dos óleos minerais. </li></ol> Dessalinização <ol start="5"><li> Remova todos os íons livres de bissulfito passando por uma coluna de dessalinização e eluição em 50 ul de água milli-Q (MQH 2 O). Dependendo da quantidade e qualidade do DNA genômico e como ele é preparado, diferentes colunas dessalinização pode ser usado. Nós usam rotineiramente Promega Assistente Clean up colunas, como estas colunas são adequados para remover o SDS utilizados na preparação do DNA antes da conversão. </li></ol> Desulphonation alcalinos <ol start="6"><li> O aduto de bissulfito é removido do anel de uracil por desulphonation. Desulphonate adicionando 5,5 mL de NaOH 3M preparada para uma concentração final de 0.3M, em seguida, incubar as amostras a 37 ° C por 15 min. </li><li> Centrifugar brevemente e adicione 1 ml de RNA t (10 mg / ml). </li> &lt;li&gt; Neutralize a solução com a adição de 33 mL de acetato de amónio (NH 4 O Ac), pH 7,0 para uma concentração final da 3M. </li><li> Etanol precipitar-DNA, adicionando a 330 mL de etanol 100% gelado, misture bem por inversão. Deixe-a 20μC para 1 hr durante a noite. Centrifugar a 14.000 g por 15 min a 4 ° C. Remover todos os vestígios do sobrenadante e ar seco o DNA precipitado para ~ 20 min. </li><li> Re-suspender o pellet de DNA em 50 ul / g de 0,1 TE (10 mM Tris-HCL, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) ou H 2 O. Deixe em temperatura ambiente por cerca de 2 horas. Ocasionalmente vortex os tubos para assegurar o DNA é dissolvido, seguido por uma centrifugação rápida. </li><li> Use imediatamente para a amplificação, ou armazenar a -20 ° C para 10-10 anos, dependendo da quantidade e qualidade do DNA. </li></ol> 4. Amplificação PCR Design de Primer <ol><li> Projeto eficaz de PCR bissulfito de conversão de primers específicos é crucial para assegurar que a amplificação, eficiente imparciais sobre DNA completamente convertido ocorre. As diretrizes a seguir são usados ​​para ajudar desenho de primers. </li></ol> Diretrizes de design Primer <img src="files/ftp_upload/3170/3170list1.jpg" /> Thermocyling <ol start="2"><li> Para testar a amplificação pela PCR proporcional de DNA metilado e não metilado, use um 50:50 metilados / unmethylated amostra de controlo totalmente convertido bissulfito e amplificar com o bissulfito de conversão de primers específicos sob o otimizado condições de reação de PCR (Figura 3). Para o metilados 50:50: controle não metilado, use in vitro DNA metilado SSSI e quer todo o genoma DNA amplificado (WGA) ou DNA de sangue total. Por favor, esteja ciente de que alguns genes metilados será naturalmente no sangue e, portanto, nesses casos o melhor é usar apenas WGA DNA como o controle &quot;não metilado&quot;. </li><li> Prepare misturas de reacção PCR em 100 &amp; mu; alíquotas l contendo 2 l de DNA genômico convertido bissulfito, 200 mM dNTP, 1 primers mM, 1,5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCL, pH 8,3 e 0,15 mL da polimerase Taq. </li><li> Em um termociclador gradiente de temperatura, defina a reação executado em um gradiente de + / - 3 ° C a partir do Tm previsto do primer em 10 tubos </li></ol><img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170table1.jpg" /><ol start="5"><li> Para testar se a metilado e não metilado amplicons foram amplificados em proporção, o amplicon pode ser digerido com uma enzima de restrição informativa, como Taq 1 (TCGA), que digerem o DNA metilado, mas não vai digerir DNA não metilado quando o site enzima de restrição é alteradas após a conversão de bissulfito de TTGA. A extensão da digestão pode ser visualizado por eletroforese em gel de agarose (Figura 3A). Alternativamente, SYBRGreen (0,2 mL de diluição de 1:1000) podem ser adicionados à reação de PCR eo grau de metilação podem ser avaliados através da realização de parcelas de calor em uma dissociação real-time PCR termociclador (Figura 3B). </li><li> PCR Reaction mix incluindo MgCl 2 condições de concentração e termociclagem pode precisar de ser ajustado para aumentar a eficiência PCR ou para assegurar a ampliação proporcional da PCR metilado e não metilado fragmentos PCR. </li><li> Uma vez que as condições são otimizadas PCR, amplificação por PCR pode ser realizada em amostras de bissulfito de convertidos. Nota: Uma vez que o Tm é otimizado uma temperatura gradiente PCR não precisa ser usado. </li></ol> 5. Resultados representativos: Um exemplo de otimização de bissulfito de amplificação por PCR é mostrado na Figura 3. Condições de amplificação ideal PCR deve amplificar metilado e não metilado amplicons, proporcionalmente e sem viés. Figura 3A mostra um gel de agarose com um perfil de temperatura de amplificação PCR gradiente de uma mistura de 50% DNA metilado e não metilado. Thamplicons e PCR têm sido tratados com uma enzima de restrição, Taq 1 (TCGA), que irá digerir metilado (M) DNA, mas não vai digerir unmethylated (U) DNA como o local enzima de restrição é alterada pela conversão de bissulfito de TTGA. Uma quantidade igual de corte e produto de PCR uncut é esperado se o DNA metilado e não metilado é amplificado na mesma proporção. Ele pode ser visto nesta gel que as condições ótimas para thermocyling não-preconceito de amplificação está em 56,1 ° C (T). Conversão completa do DNA de bissulfito também podem ser analisados ​​por digestão com enzima citosina-site específico, como Hpa III (CCGG). Hpa III só vai digerir se a conversão falhou, como o sítio de restrição será mantida. Se a conversão for concluída o sítio de restrição serão convertidos para TCGG ou TTGG dependendo do estado de metilação do DNA. Conversão de DNA completa de bissulfito pode ser visto na Figura 3A (H). Figura 3B mostra um gráfico em tempo real que a dissociaçãotambém pode ser usado como uma ferramenta para determinar se existe qualquer viés de amplificação com base na temperatura em que as diferentes moléculas que se dissociam. Nesta figura pode-se ver que a PCR ampliou metilado (M) e não metilado de DNA (U), na proporção de uma mistura de 50% DNA metilado e não metilado em comparação com a amplificação de DNA de controle totalmente metilado e não metilado, que se dissociam em 82.1μC e 78.9μC respectivamente. Após a otimização das condições de reação thermocyling e bissulfito de amostras tratadas pode ser amplificada com vertente específica e bissulfito de primers específicos em qualquer uma reação de PCR simples ou semi nested. Os fragmentos resultantes PCR pode ser visualizado por eletroforese em gel de agarose e seqüenciados diretamente (Figura 4A) ou por clonagem e seqüenciamento. Depois de clonagem e sequenciamento do estado de metilação das moléculas individuais podem ser tabulados, em um mapa de bissulfito (Figura 4B), para visualizar a heterogeneidade dosmetilação. Alta taxa de análise de metilação quantitativa pode ser pré-formados usando a tecnologia como a utilizada pelo método EpiTYPER Sequenom. Usando este método, o DNA convertido bissulfito é amplificado com bissulfito PCR primers específicos e seguido por um processo de clivagem proprietry. Os fragmentos resultantes são quantificados por MALDI-TOF espectrometria de massa com o espectro específico depende da presença de citosinas metiladas (Figura 5A). Um resumo das razões de metilação na amostra pode ser extrapolado, na forma de um epigrama (Figura 5B) ou parcela de metilação (Figura 5C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática CpG metilado. Na célula normal, promotor associado ilhas CpG não metiladas são predominantemente (cinza), enquanto sites de CpG no gene corpos são escassos e geralmente metilado (vermelho). O painel da direita se expande a estrutura molecularure de DNA em um site individual CpG e mostra metilação com uma molécula de carbono CH3 em 5 de citosina. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig2.jpg" /> Figura 2. . Chemical esquema de conversão Análise de metilação do DNA inclui quatro fases principais, como mostrado; desnaturação, a conversão de bissulfito, amplificação e análise. No painel direito, modificações na molécula de citosina que ocorrem durante a conversão de bissulfito são retratados. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig3.jpg" /> Figura 3. Otimização de PCR de amplificação. A. Eletroforese em gel de agarose com um perfil de temperatura de amplificação PCR gradiente de uma mistura de 50% DNA metilado e não metilado. Fragmentos foram digeridos com o Taq1 (T) ou HpaIII (H), que digerem o DNA metilado e DNA bissulfito não convertido, respectivamente. B. Calor análise da curva de dissociação mostra uma equal proporção de DNA metilado e não metilado (linha vermelha mix 50/50) em comparação com o controle de amplificação totalmente metilados (linha rosa, M) e DNA não metilado (linha verde, U), que se dissociam de 82,1 ° C e 78,9 ° C, respectivamente. <img alt="Figura 4a" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4a.jpg" /> <img alt="Figura 4b" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4b.jpg" /> Figura 4. Exemplo de seqüenciamento direto e um mapa de bissulfito. A. Trace seqüência de três linhas de células diferentes com sítios CpG realçado em amarelo. Célula da linha X exibe metilação 100% em todos os três locais CpG enquanto célula linhas Y e Z mostram diferentes graus de metilação, como visto pela sobreposição G / A sinais. B. Representante bissulfito mapa que mostra a densidade de metilação (pontos vermelhos) em sites individuais CpG, conforme determinado pelo seqüenciamento direto de clones individuais. <img alt="Figura 5a" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig5a.jpg" /> Figura 5. Alta taxa de análise de metilação do DNA usando Sequenom. A. Vista espectro usando a tecnologia Sequenom epiTYPER. Fragmentos de DNA mostrar espectros específicos, dependendo da quantidade de presentes a metilação do DNA. B. Epigram resumo da porcentagem de metilação do DNA em cada local de CpG por quatro diferentes linhagens celulares. C. resumo do enredo de metilação derivado da Epigram Sequenom.

<ol>
	<li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1827-1831 (1992).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic. Acids. Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Grunau, C., Clark, S. J., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisulfite+genomic+sequencing:+systematic+investigation+of+critical+experimental+parameters.">Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters.</a> Nucleic. Acids. Res. 29, E65-E65 (2001).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+bisulphite+modification+and+analysis.">DNA methylation: bisulphite modification and analysis.</a> Nat. Protoc. 1, 2353-2364 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Análise de DNA por metilação do DNA sequenciamento genômico convertido bissulfito é um método bem estabelecido e versátil, que facilita a identificação e quantificação de metilação do DNA em resolução de nucleotídeo único. No entanto, a conversão de bissulfito e posterior análise baseia-se na premissa de que o DNA foi totalmente convertido com cada citosina unmethylated sendo desaminada de uracil e só citosinas metiladas restantes un-reativa. Se a conversão é incompleta, podem surgir problemas com a análise já que não convertida citosinas não metiladas podem ser incorretamente interpretado como citosinas metiladas. Conversão de bissulfito pode ser otimizado em vários estágios para maximizar a percentagem de conversão. Para o DNA para ser totalmente convertida em primeiro lugar deve ser fita simples de modo que os resíduos de citosina estão expostos aos íons bissulfito. O primeiro passo, desnaturação do DNA, é crítico e pode ser a fonte de conversão incompleta se o DNA não é totalmente desnaturado. Para garantirque o DNA é totalmente desnaturado, é importante que os parâmetros de reação, incluindo a remoção de todas as proteínas associadas, concentração de sal adequada, a temperatura de incubação e tempo são adequados para manter o DNA na conformação de fita simples. É importante usar fresco 3M NaOH e para dar tempo de incubação adequada. Se o DNA está resistindo desnaturação, algumas modificações no protocolo incluindo o alargamento do tempo de incubação a 30 minutos ou a fragmentação do DNA antes da desnaturação pode facilitar a desnaturação do DNA. Além disso, DNA de fita simples (ssDNA) pode re-anneal dobrar DNA de fita (dsDNA) durante a reação de conversão de bissulfito. Realizar a reação a uma temperatura superior (90-95 ° C) ou periodicamente, ou de forma contínua durante a reação de bissulfito pode ajudar a manutenção de ssDNA. No entanto, é importante estar ciente de que a degradação do DNA é muito acelerado a estas temperaturas mais elevadas. Vários reagentes também pode ser adicionado para interromper re-annealing of thfitas de DNA e, como a uréia. A concentração de DNA e sua qualidade também pode afetar a eficiência da reação de bissulfito PCR e rendimento final. Degradação do DNA é uma limitação do protocolo de conversão de bissulfito. O tratamento químico do DNA introduz rupturas dos filamentos vários ssDNA e algumas das duras condições necessárias para a conversão de bissulfito completo, incluindo concentração de bissulfito de alta, os tempos de incubação longo podem acelerar a degradação do DNA. Nas condições de reação padrão descrito, a degradação do DNA não é um problema comum no entanto, se as modificações de protocolo são introduzidos, como por sequências que são refratários à conversão, para modelos de DNA que estão degradadas ou de baixa qualidade, tais como amostras de FFPE, em seguida, degradação do DNA pode se tornar uma limitação significativa. Formalina parafina, fixo incorporado (FFPE) e amostras de DNA degradado pode ser efetivamente bissulfito convertido e amplificado utilizando este protocolo, No entanto modificações para garantir que o DNA não é mais degradadas são aconselhados. O uso de uma RNA transportador, tais como t RNA é recomendado. Glicogênio também pode ser adicionado como um transportador quando a concentração de DNA é baixa (&lt;200 ng). Como o DNA isolado de tecidos FFPE já está fragmentado e fragmentação ocorre durante desaminação, os cuidados devem ser tomados para minimizar a degradação ainda mais. Não fragmento de DNA mais longe antes de desnaturação e limitar o tempo de incubação para a reação bissulfito a 4 horas. Design amplicons não maior do que 300 bp DNA devido a fragmentada. Outro fator que pode afetar a amplificação por PCR que a conversão de bissulfito de citosinas não metiladas reduz a complexidade do modelo de DNA. O protocolo do projeto a seguir cartilha descritos na seção 4.1, o comprimento aumentou primário e PCR aninhado podem ajudar a aumentar a especificidade e rendimento de PCR. Finalmente, uma vez que o modelo de DNA é alterada durante bisulphite de conversão, o viés de amplificação pode ser uma preocupação. Garantir que a amplificação PCR proporcional de modelos metilado e não metilado é verificada com um controle de mix 50/50 DNA M / U, conforme descrito no protocolo, veja a Figura 3. Também garantir que a amplificação de modelos apenas convertido está ocorrendo usando HpaIII enzima de restrição e eletroforese em gel (Figura 3). As condições de PCR podem precisar de ser otimizado através da variação da temperatura e concentração de / ou magnésio ou alongamento do tempo de extensão. Alguns modelos parecem ser particularmente problemática ea posição cartilha pode ter de ser ajustada ou iniciadores degenerados podem precisar de ser usado. Técnicas de sequenciamento de última geração estão evoluindo rapidamente para conseguir uma resolução semelhante à de bissulfito de sequenciamento genômico, ea terceira geração de seqüenciamento única molécula tem potencial para permitir a análise de DNA de ambos primários e metilação sem a necessidade de seqüenciamento de bissulfito. No entanto, disponibilidade generalizada e especificaçõesificity destas técnicas permanecem algum tempo afastado. Sequenciamento genômico bissulfito é o padrão-ouro na análise de metilação e é um protocolo robusto. O método tem progredido ao ponto onde os problemas comuns e limitações foram resolvidas e as aplicações têm se expandido a partir de análises de genes individuais de alto rendimento e análise de genoma descrito por Clark et al. 2006 4. Diretrizes solução de problemas e recomendações adicionais estão descritos na Tabela 1. Sugere-se que a abordagem ideal é inicialmente seguir o protocolo padrão e apenas introduzir modificações se e quando surge um problema. <img src="/files/ftp_upload/3170/3170table2.jpg" alt="Tabela 2" /> Tabela 1. Diretrizes Troubleshooting

<ol><li> Metabissulfito de sódio (Ajax Finechem) </li><li> Hidroquinona (Merck) </li><li> Assistente do sistema DNA-clean-up (Promega) </li></ol>

dna methylation: bisulphite modification and analysis

Epigenética descreve as mudanças hereditárias em função do gene, que ocorrem de forma independente para a seqüência de DNA. A base molecular da regulação do gene epigenético é complexa, mas essencialmente envolve modificações no próprio DNA ou as proteínas com as quais DNA associados. A modificação epigenética predominante de DNA em genomas de mamíferos é a metilação dos nucleotídeos citosina (5-MEC). Metilação do DNA fornece instruções para máquinas de expressão gênica de onde e quando o gene deve ser expresso. A seqüência alvo principal para a metilação do DNA em mamíferos é 5&#39;-CpG-3 &#39;dinucleotídeos (Figura 1). Dinucleotídeos CpG não são uniformemente distribuídos por todo o genoma, mas estão concentrados em regiões de seqüências genômicas repetitivos e CpG &quot;ilhas&quot; comumente associado com os promotores de gene (Figura 1). Padrões de metilação do DNA são estabelecidos no início do desenvolvimento, modulados durante a diferenciação de tecidos específicos e interrompida em muitos estados de doenças incluindo o câncer. Para understand o papel biológico de metilação do DNA e seu papel na doença humana, precisa, eficiente e reprodutível métodos são necessários para detectar e quantificar cada 5-MEC. Este protocolo para a conversão de bissulfito é o &quot;padrão ouro&quot; para a análise de metilação do DNA e facilita a identificação e quantificação de metilação do DNA em resolução de nucleotídeo único. A química da desaminação de citosina por bissulfito de sódio envolve três etapas (Figura 2). (1) sulfonação: A adição de bissulfito à ligação 5-6 dobro de citosina Desaminação (2) hydrolic: desaminação hidrolítica do derivado resultante citosina-bissulfito de dar um derivado uracil bissulfito (3) Desulphonation Alkali: A remoção do sulfonato grupo por um tratamento alcalino, para dar uracil. Bissulfito preferencialmente deaminatos de citosina a uracil em DNA de fita simples, enquanto o 5-MEC, é refratária ao bissulfito mediada desaminação. Após a amplificação pela PCR, uracila é amplificadacomo timina enquanto 5-MEC resíduos permanecem como citosinas, permitindo CpGs metilado para ser distinguido de CpGs unmethylated pela presença de um &quot;C&quot; versus citosina timina &quot;T&quot; de resíduos durante o seqüenciamento. DNA de modificação pela conversão de bissulfito é um protocolo bem estabelecido que pode ser explorado para muitos métodos de análise de metilação do DNA. Desde a detecção de 5-MEC pela conversão de bissulfito foi primeiramente demonstrada por Frommer et al. 1 e Clark et al. 2, os métodos baseados em torno de conversão de bissulfito de conta de DNA genômico para a maioria dos novos dados sobre a metilação do DNA. Diferentes métodos de análise pós PCR podem ser utilizados, dependendo do grau de especificidade e resolução de metilação necessário. Clonagem e sequenciamento é ainda o método mais prontamente disponíveis que podem dar resolução de nucleotídeo único para metilação do outro lado da molécula de DNA.

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DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

O padrão ouro para a análise de metilação do DNA é sequenciamento genômico de DNA convertidos bissulfito. Este método tira vantagem do aumento da sensibilidade em comparação com 5 citosina-metilcitosina (5-MEC) para bissulfito de desaminação em condições ácidas. Citosinas não metiladas pode ser distinguida de citosinas metiladas após a amplificação do DNA genômico alvo.

A metilação do DNA: Modificação e Análise de bissulfito

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

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Research

JoVE Journal

Biology

104.1K visualizações.  Garvan Institute of Medical Research. O padrão ouro para a análise de metilação do DNA é sequenciamento genômico de DNA convertidos bissulfito. Este método tira vantagem do aumento da sensibilidade em comparação com 5 citosina-metilcitosina (5-MEC) para bissulfito de desaminação em condições ácidas. Citosinas não metiladas pode ser distinguida de citosinas metiladas após a amplificação do DNA genômico alvo.

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PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS Fabricação de dispositivos e modificação da superfície

Biologia

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Determinação de metilação de DNA de genes marcados em Arabidopsis Endosperma

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Branching morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the study of branching morphogenesis. In the developing SMG, this process involves iterative steps of epithelial bud and duct formation, to ultimately give rise to a complex branched network of acini and ducts, which serve to produce and modify/transport the saliva, respectively, into the oral cavity1-3. The epithelial-associated basement membrane and aspects of the mesenchymal compartment, including the mesenchyme cells, growth factors and the extracellular matrix, produced by these cells, are critical to the branching mechanism, although how the cellular and molecular events are coordinated remains poorly understood 4. The study of the molecular mechanisms driving epithelial morphogenesis advances our understanding of developmental mechanisms and provides insight into possible regenerative medicine approaches. Such studies have been hampered due to the lack of effective methods for genetic manipulation of the salivary epithelium. Currently, adenoviral transduction represents the most effective method for targeting epithelial cells in adult glands in vivo5. However, in embryonic explants, dense mesenchyme and the basement membrane surrounding the epithelial cells impedes viral access to the epithelial cells. If the mesenchyme is removed, the epithelium can be transfected using adenoviruses, and epithelial rudiments can resume branching morphogenesis in the presence of Matrigel or laminin-1116,7. Mesenchyme-free epithelial rudiment growth also requires additional supplementation with soluble growth factors and does not fully recapitulate branching morphogenesis as it occurs in intact glands8. Here we describe a technique which facilitates adenoviral transduction of epithelial cells and culture of the transfected epithelium with associated mesenchyme. Following microdissection of the embryonic SMGs, removal of the mesenchyme, and viral infection of the epithelium with a GFP-containing adenovirus, we show that the epithelium spontaneously recombines with uninfected mesenchyme, recapitulating intact SMG glandular structure and branching morphogenesis. The genetically modified epithelial cell population can be easily monitored using standard fluorescence microscopy methods, if fluorescently-tagged adenoviral constructs are used. The tissue recombination method described here is currently the most effective and accessible method for transfection of epithelial cells with a wild-type or mutant vector within a complex 3D tissue construct that does not require generation of transgenic animals.

A technique to genetically manipulate epithelial cells within whole ex vivo cultured embryonic mouse submandibular glands (SMGs) using viral gene transfer is described. This method takes advantage of the innate ability of SMG epithelium and mesenchyme to spontaneously recombine after separation and infection of epithelial rudiments with adenoviral vectors.

Modificação genética e recombinação de culturas de órgãos de glândula salivar

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Um método eficiente para Quantitativa, Análise de células Único de cromatina Modificação e Arquitetura Nuclear em Todo-mount óvulos em<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

De gravidade reduzida Manifestações ambiente de hardware de uma tecnologia de mistura de fluxo Cytometer e Companion microfluídicos Prototype Miniaturized

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

A metilação in vitro Ensaio de Proteína Estudo Arginina metilação

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Aprimorada Redução Representação Bisulfite Sequencing para a Avaliação de metilação de DNA na resolução de pares de bases

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.