Mecanismos de reparação de DNA são muito importantes para manter a integridade do genoma em todos os organismos vivos. Uracil-DNA glicosylase é uma proteína crucial de reparação de DNA na via básica de reparação de tecidos. Usando espectrometria de massa MALDI-TOF, podemos detectar diretamente o produto AP para ensaio de atividade enzimático.
O ensaio convencional de glicosylase requer trabalho de substrato. Este método é livre de rótulos e detecta diretamente a mudança de massa de um substrato uracil para o produto AP. Outras vantagens incluem alta especificidade, versatilidade, escalabilidade, rapidez e facilidade de execução.
Usamos e.coli uracil-DNA glycosylase como exemplo. Este método pode ser facilmente modificado para outros ensaios de glicosylase de DNA. Pessoal de laboratório bem treinado com habilidades precisas de tubulação e diluição são essenciais.
Reagentes recém-preparados e tampões de sal baixos devem ser usados para melhores sinais e menor ruído de fundo. Demonstrando o procedimento estará Hui-Lan Chang, um estudante de doutorado do meu laboratório. Para um ensaio de glicosylase de DNA usando substrato de base guanina-uracil de T1 U+9 duplex, adicionar 70 microliters de água, 10 microliters de 10X uracil-DNA glicosylase ou tampão de reação UDG, cinco microliters de estoque T1, e cinco microliters de estoque U+9 em um tubo de microcentrifuse esterilizado de 1,5 mililitros.
Feche o tubo antes de incuba-lo em um banho de água por 30 minutos a 65 graus Celsius, seguido de 30 minutos a 37 graus Celsius, e finalmente no gelo por três minutos para garantir o bom enlaamento do duplex do modelo de substrato. Em seguida, em um novo tubo de 1,5 mililitro, adicione 49 microliters de tampão de reação UDG frio e um microliter de UDG diluído, em seguida, prepare diluições seriais com o buffer UDG para as concentrações de enzimas desejadas e coloque o UDG diluído no gelo. Em seguida, em outro tubo de 1,5 mililitro, adicione nove microliters da mistura de substrato preparado e pré-ataque a 37 graus Celsius, em seguida, adicione um microliter do UDG diluído e flick o tubo para misturar o conteúdo.
Centrifufique brevemente a mistura de reação e coloque o tubo imediatamente para incubação a 37 graus Celsius. Use o temporizador para cronometrar a reação. Para a terminação de reação, prepare 0,25 ácido clorídrico molar e solução de base 0,23 molar tris.
Use o medidor de pH para confirmar o pH ao preparar o reagente e testar por tira de pH antes de operar a etapa de terminação de reação, depois acidificar 10 microliters de tris-EDTA com um microliter de 0,25 ácido clorídrico molar e garantir que o pH esteja em torno de dois mais ou menos 0,5. Neutralizar a solução com um microliter de base tris e garantir que o pH final esteja em torno de 6,5 mais ou menos 0,5. Em seguida, adicione um microliter de 0,25 ácido clorídrico molar à mistura de reação para inativar a enzima e colocar o tubo no gelo por seis minutos, em seguida, adicione um microliter de base tris para neutralizar os produtos de DNA e evitar a quebra do local AP por exposição prolongada ao ácido.
Depois de adicionar 13 microliters de tris-EDTA para aumentar o volume da mistura do produto para transferência de chips de matriz, coloque o tubo no gelo. Finalmente, transfira todos os 25 produtos de reação UDG de microcentrículos para uma placa de microtiter de 384 poços. Abra a porta do distribuidor de nanoliter e carregue a placa de microtítmetro de 384 poços no suporte da placa do convés e, em seguida, insira a matriz do chip na posição correspondente da placa de batedor.
Coloque a placa de batedor carregada no convés de processamento do distribuidor de nanoliter e feche a porta. Toque no botão de execução na tela de transferência e aguarde que o instrumento comece a distribuir amostras da placa de microtítiter para o chip matrix. Em seguida, usando a opção de guia de visão, mostre a imagem do chip e os volumes de distribuição para cada ponto durante a dispensação.
Certifique-se de que o volume manchado no chip esteja na faixa de cinco a 10 nanoliters. Usando o programa de aplicação apropriado, prepare um arquivo xlsx contendo o valor de sinal M por Z previsto para importação. Em seguida, use o programa de aplicativos para criar e definir um novo ensaio UDG clicando com o botão direito do mouse no grupo de ensaio de importação na opção de formato de designer e selecionando o arquivo Excel da lista suspensa.
Em seguida, clique com o botão direito da placa de projeto do cliente e clique na parte superior da árvore de opção suspensa para estabelecer uma nova placa de ensaio. Em seguida, na caixa de diálogo, digite um nome de arquivo. E no tipo de placa suspensa, selecione o tipo de placa de 384 poços.
Pressione OK e espere que uma placa em branco apareça à direita da tela. Em seguida, clique na opção ensaio e selecione o ensaio na lista suspensa. Para atribuir o ensaio selecionado a cada posição de ponto de amostra na placa, mova o cursor para cada posição da placa em branco, clique para destacar o poço e clique com o botão direito do mouse para selecionar adicionar placas.
Usando um computador desktop ou laptop, prepare uma lista de trabalho em formato xlsx sem cabeçalho para todas as amostras no chip e clique no novo botão de projeto de amostra e selecione o arquivo da lista suspensa para importar a lista de trabalho. Procure todos os códigos de amostra de teste na lista de trabalho à esquerda da tela e clique em um código de amostra na lista de trabalho e clique com o botão direito do mouse na posição correspondente da placa para vincular os testes a cada posição. Pressione o botão de dentro/para fora do espectrômetro de massa para estender o convés e retirar o suporte do chip.
Insira o chip de amostra no suporte do chip, coloque o suporte do chip carregado no convés estendido e pressione novamente o botão de entrada/saída para que o chip de amostra entre no instrumento. No programa de controle de espectrômetro de massa, clique duas vezes no ícone de aquisição. Na janela de aquisição, clique na guia de execução automática para iniciar o instrumento e adquira espectros de massa das amostras no chip.
Para análise de dados, execute o programa de análise de dados e, em seguida, navegue na árvore do banco de dados e selecione o ID do chip.Clique para destacar um alvo bem no chip e clique no ícone de espectro para mostrar o espectro de massa. Clique com o botão direito do mouse para escolher a caixa de diálogo de personalização e cortar uma faixa de espectro específica em uma nova janela, em seguida, clique no eixo x para digitar nos limites superior e inferior de M a Z e pressione OK para mostrar o espectro de alcance especificado, incluindo os sinais de interesse. Para medir a altura máxima dos valores M por Z correspondentes ao substrato uracil, produto AP e modelo, clique no pico e veja a altura máxima no canto superior esquerdo da tela.
Finalmente, para salvar o espectro para registro, a exportação com o botão direito do mouse é exportação e selecione o tipo de arquivo como JPEG na lista suspensa. Clique no destino e navegue em disco para selecionar o dispositivo de armazenamento na lista suspensa e digite o nome do arquivo e clique em exportar. O sistema modelo para um teste de glicosylase de DNA é mostrado aqui.
O DNA do modelo nucleotídeo de 19 nucleotídeos permaneceu inalterado após a hidrólise da glicosila. Portanto, o sinal poderia servir de referência para a quantitação do produto AP. A diferença de um nucleotídeo entre o substrato e o modelo correspondente produziu um perfil de sinal bem separado para ambos.
O sinal do produto AP também foi bem separado do do substrato contendo uracil. Para a análise dos dados de MS, as alturas máximas foram medidas. A análise do curso de tempo para a atividade de UDG em 0,01, 0,02, 0,05 e 0,1 demonstrou tanto a dose quanto a dependência do tempo.
Um exemplo de gráfico de taxa de reação com intensidades relativas de sinal de MS do produto e substrato em concentrações nanomolar é mostrado aqui. A taxa de reação do UDG é apresentada como nanomoles do site AP produzido por segundo. O KM e o VMAX foram calculados a partir do enredo lineweaver Burk.
A unidade medida de espectrometria de massa MALDI-TOF foi proporcional à unidade definida de 0,001 unidades a 0,02 unidades com coeficiente de determinação apreciável. A inibição da atividade UDG por um inibidor de glicossilase uracil é mostrada aqui. Na presença de 100 picomoles do inibidor, a atividade de 0,05 unidades de UDG foi inibida a um nível indetectável e o IC50 foi encontrado como 7,6 picomoles.
Uma vez que o tamanho de AP é labile e pode ser hidrolisado por uma reação beta de eliminação em pH extremo e temperatura elevada, a sacieçação do ensaio deve ser realizada no gelo para o período definido. Além disso, use um medidor de pH para garantir que o HCL acidifique o tampão de reação à base de pH e tris desejada neutralizada adequadamente a mistura do produto. Este método também pode ser modificado para analisar glicosilase de DNA bifunctional.
Por exemplo, U+2 T3 é um substrato adequado para ensaio de DNA glicosylase formamidopyrimidina. Os produtos de decote da atividade de ligase FPG AP podem ser facilmente detectados pela massa MALDI-TOF. Este método tem o potencial de se tornar o método de referência para a medição monofuncional da glicosilase e também pode ser usado como uma ferramenta para triagem inibidora de glicosylase para o desenvolvimento farmacêutico.
