O uso de MAC para observar alterações precoces após o transplante de tecido ovariano tem uma vantagem significativa sobre os modelos in vitro, pois permite a investigação dos mecanismos que afetam o processo de vascularização precoce e perda de folículos. Esta técnica é de baixo custo, podendo ser realizada sem risco de rejeição do enxerto devido à imunodeficiência natural do embrião nos primeiros 17 dias. Além disso, esta abordagem não suscita quaisquer preocupações éticas ou jurídicas em termos de direito europeu.
A melhor estratégia para desenvolver as habilidades manuais necessárias para a manipulação de ovos pode ser alcançada por meio de treinamento com ovos não embrionados antes do experimento real. Para começar, rotule o dia zero ovos recebidos de Louvain selecionou pintinhos de leghorn branco usando um marcador. Incube os ovos em uma incubadora fixada a 37 graus Celsius, com as extremidades pontiagudas voltadas para baixo.
Gire os ovos em 180 graus, duas a três vezes ao dia manualmente. No escuro, coloque uma vela de ovo contra a casca do ovo e identifique o centro da bolsa de ar na casca do ovo usando um marcador. Acenda as luzes e gire um pino reto estéril na posição marcada para fazer uma abertura de cerca de um milímetro.
Localize o saco de gema no escuro usando o veleiro de ovo. Puncione o ovo com uma agulha estéril de calibre 19, angulada a 45 graus em direção ao fundo do ovo, sem interromper o saco de gema. Aspirar 1,5 a dois mililitros de albumina para desprender a CAM da casca.
Em seguida, feche o orifício com fita adesiva. Acenda as luzes e desenhe uma janela retangular medindo um por 1,5 centímetros no ovo colocado horizontalmente. Segure o ovo em uma das mãos e corte suavemente uma janela na casca do ovo, usando uma lâmina de serra de rolo, sem quebrar a casca.
Sopre regularmente para remover o pó da casca e detritos. Deslize pinças estéreis sob a peça retangular da concha e remova-a de forma limpa sem danificar o CAM. Em seguida, descarte a membrana da casca externa branca para ver o embrião e o CAM.
Em ovos embrionados viáveis, albumina clara, um anel vascular ao redor do embrião e, às vezes, um coração batendo, são vistos no terceiro dia de desenvolvimento do embrião de pintinho. Sob a coifa de fluxo laminar, coloque o ovo na prateleira de ovos com a janela voltada para cima e descasque a fita. Coloque delicadamente e remova imediatamente uma tira quadrada de um centímetro de papel de lente estéril extraído com éter na superfície epitelial, para traumatizar uma pequena área do CAM.
Em seguida, segure uma tira cortical ovariana congelada descongelada com pinça microcirúrgica e coloque-a na MAC traumatizada com o lado medular contra a MAC. Avaliar macroscopicamente o enxerto e prestar especial atenção à reação vascular da CAM em relação ao enxerto antes de capturar fotografias ou vídeos digitais. Uma vez feito, retire o enxerto agarrando o tecido ou a CAM circundante com pinça e excisando cuidadosamente o enxerto da CAM usando tesoura.
Os enxertos foram viáveis em 100% dos casos após o primeiro dia de enxertia. Eles já estavam parcialmente aderentes ao MAC e apresentavam o padrão wheel spoke dos vasos sanguíneos necessários para sua vascularização. Após seis dias da enxertia, os implantes foram aderidos ao CAM.
Por volta do terceiro dia pós-transplante, os enxertos foram cobertos com uma segunda camada de CAM e tornaram-se encapsulados. O enxerto apresentou boa vascularização, com 80% dos transplantes penetrando no óvulo. Dois enxertos não se fixaram às MAC e assumiram aspecto necrótico, resultando em uma taxa de sobrevida tecidual enxertada de 83% após seis dias.
Na avaliação histológica do transplante, folículos sadios foram observados em todos os momentos. Após o transplante, observou-se diminuição insignificante das densidades foliculares. As taxas de sobrevivência dos folículos foram mantidas durante o período de enxertia em 95% no primeiro dia e 83% no sexto dia.
A parte mais desafiadora é fazer o pequeno orifício necessário para aspirar a albumina, para desprender o CAM da casca do ovo, antes de criar uma janela de aplicação. Muita pressão pode resultar em superestimulação, ou até mesmo rachar e destruir o ovo, causando danos irrevogáveis à CAM ou à sua vasculatura. Esse modelo é ideal para testar vários aspectos do período inicial pós-enxertia de tecido ovariano, incluindo o impacto de fatores pró-angiogênicos, agentes antioxidantes protetores, citocinas, hormônios e outros fatores que controlam a ativação e o crescimento precoce dos folículos.
Esse modelo indicou a ligação entre vascularização precoce e modulação da ativação folicular, que são os dois principais eventos que resultam no declínio da reserva ovariana após o transplante de tecido ovariano.
