Os autores gostariam de agradecer a J. e J. Kueper Wittschier de assistência técnica excelente e Ruebben Prof generosamente para fornecimento de material de tumor.

Todos os equipamentos e reagentes têm de ser comprados estéril ou deve ser de calor ou vapor esterilizado ou esterilizado com ETOH 70%. Os autores afirmam que experiências em animais foram realizados de acordo com as Comunidades Europeias Directiva do Conselho (86/609/CEE), seguindo as orientações do NIH sobre o cuidado e uso de animais em procedimentos experimentais e os regulamentos estabelecidos pelo animal Institucional Cuidado e Uso Committee (IACUC) da Universidade de Duisburg-Essen (Alemanha). Parte 1: Incubação de ovos <ol><li> Ovos fertilizados podem ser armazenadas a 13 ° C por até uma semana. </li><li> Os ovos são incubados por 72 horas, encontrando-se horizontalmente em uma incubadora com uma bandeja de mover, girar os ovos 12 vezes por dia continuamente. Umidade é mantida em 60-62%, temperatura de incubação a 37,5 ° C. Nota: Antes de iniciar a incubação, sujeira, excrementos e penas são cuidadosamente removidas as cascas de ovo mecanicamente por limpeza a seco com comum, cinza zigzag toalhas de papel, que tem um áspero ao invés de uma estrutura de superfície macia. Limpando os ovos com etanol ou desinfetante, no entanto, reduziu significativamente a taxa de sobrevivência dos embriões, independentemente do líquido usado. </li></ol> Parte 2: Ex cultura ovo <ol><li> Após a incubação por 72 horas, os ovos são retirados da incubadora. Nota: Os ovos são incubados por 72 horas porque - de acordo com nossas experiências - por razões desconhecidas, mas de acordo com Auerbach et al.1 fases de desenvolvimento anteriores tinham taxas de sobrevivência significativamente menor. Em fases posteriores de 72 horas do saco vitelino, que ainda não está coberto pelo CAM torna-se mais fina e tende a aderir à casca do ovo líder (i) a pequenas hemorragias na área de adesão e (ii) a ruptura da gema saco- membrana. Portanto, o método apresentado não é aplicável aos embriões com mais de 72 horas. </li><li> A parte superior dos ovos, onde reside o embrião, é marcado por lápis desde o embrião resiste a rotação até certo ponto. </li><li> O ovo está na horizontal com a marca de lápis em cima e rachada na borda de uma barra de agitação 80 milímetros triangular magnética perpendicular postura orientada ao longo eixo do ovo. Nota: Para um melhor sentimento, sem luvas devem ser utilizadas, mas as mãos devem ser desinfectadas com EtOH 70%. É importante que a casca do ovo, bem como a membrana de ovo são abertos. Vazamento de clara de ovo é um sinal seguro de que a membrana do ovo tem sido perfurado. </li><li> O ovo é mantida perto do fundo da placa de Petri para evitar vazamento de mais de clara de ovo. Nota: Durante o procedimento de abertura inicial, é importante que a clara de ovo no fundo da placa de Petri ainda está conectado com o resto dentro do ovo, pois isso resulta em um vácuo dentro do ovo que detém a gema com o embrião em cima dentro o ovo. O vácuo pode ser regulada tanto por pressão do dedo que controla a entrada de ar para dentro do ovo ou levantando o ovo que aumenta a coluna de conectado clara de ovo ou seja, o vácuo. </li><li> Suavemente aplicar pressão ao meridiano que atravessa o crack e equador do ovo com o polegar eo dedo médio, é possível regular o vácuo. O conteúdo do ovo pode então ser transferido para a placa de Petri sem danos, se o ovo com a gema é suavemente levantado e ambas as metades da casca são cuidadosamente separados. O embrião e os vasos gema deve ficar no topo de uma gema intacta. Nota: Se a marca de lápis não é mantido no topo, o embrião pode ser ferido quando quebra a casca. Se os ovos não estão rachados com cuidado suficiente, ou os embriões são mais de 72 horas (veja acima), o saco vitelino adere ao shell e freqüentemente rupturas. O mesmo acontece quando a umidade da incubadora é inferior a 60% ou ovos não são rodados durante a incubação. </li><li> Ex culturas ovo são retornados para uma incubadora e mantidos a 37,5 ° 38,2 ° C e umidade de 60%. CO 2 ou O fornecimento de 2 não é necessário se a incubadora não é fechado hermeticamente (grade de ventilação parcialmente aberta!) E pratos especiais Petri com espaçadores entre tampa e prato são usados. Nota: Mudança de os embriões devem ser mantidos a um mínimo durante os primeiros dias de incubação. Demais resultados agitação em altas taxas de mortalidade. De incubação dia 9 em diante, os embriões são menos sensíveis à agitação. Embriões mortos devem ser removidos imediatamente para evitar infecções. Se incubadoras de cultura de células são usadas, que são fechados hermeticamente, O fornecimento de 2 é obrigatório para os embriões não morrer. A umidade é essencial para não o CAM a secar e se a temperatura de incubação é inferior a 37 ° C, os embriões se desenvolvem muito lentamente. </li></ol> Parte 3: Aplicação de substâncias para ensaios de angiogênese <ol><li> Autoclavado dobrado papéis de filtro (50,5 milímetros de diâmetro) são perfurados por um furador e usado como material de apoio (transporte) para substâncias líquidas aplicadas ao CAM. Nota: Quase material de cada operadora (veja tabela abaixo) causou irritação do CAM, especialmente quando aplicado antes do dia de incubação 10, como ele mudou a arquitetura navio desenvolvimento CAM. Isso também incluiu substâncias potencialmente inerte como a folha de hidroxietilcelulose, esponjas Teflon (PTFE-pledgets), esponjas de colágeno, folha de colágeno, gaze estéril (cotonetes), lamínulas redondas, e anéis de silicone, o que causou todos os resultados falso-positivos. Papel de filtro parecia causar o mínimo de irritação e, portanto, foi utilizado em nossos ensaios. </li><li> Quando o CAM está totalmente desenvolvido, até 6 amostras diferentes podem ser aplicadas e seus efeitos podem ser comparados em uma única CAM. </li><li> Para evitar a secagem filtros doses adicionais (3 mg angiotropin nativo) ou tampão (5 mL PBS) deve ser reaplicado a cada dia. </li><li> A partir de dia 3 após a aplicação, os vasos sanguíneos se orientar em direção a substâncias angiogênicas nos filtros, enquanto que o padrão de vasos sanguíneos ao redor controles é inalterada. Nota: O CAM não deve ser confundida com a gema saco. O CAM é uma estrutura dinâmica de desenvolvimento, enquanto o saco vitelino é estática com variações pouco durante o desenvolvimento. No dia três, o desenvolvimento CAM em desenvolvimento podem ser reconhecidos, pela primeira vez na extremidade caudal do embrião como uma pequena vesícula. Entre os dias três e dez dias da vesícula inicial se expande, criando uma membrana de duas camadas dobradas overgrowing o saco vitelino em uma taxa crescente. O local de aplicação deve ser meio caminho entre embrião e da dobra do CAM (fronteira) conforme o embrião dificulta a observação microscópica de efeitos de luz transmitida. Alternativamente, o filtro com a substância angiogênico é internalizado quando o CAM continua crescendo. </li></ol> Parte 4: A inoculação de células para o CAM 4.1.Preparation de células <ol><li> Células confluentes são transferidos da garrafa de cultura para tubos FALCON pelo uso de uma pipeta estéril, 25 ml usando uma ajuda da pipeta. </li><li> Para estimar o número de células, 15 mL da suspensão de células é transferido para uma câmara de Neubauer e as células são contadas manualmente sob um microscópio. </li><li> Tubos Falcon são centrifugadas por 3 min a 1000 rpm em temperatura ambiente eo sobrenadante é descartado. </li><li> Para rastreamento de células vivas, as células são diluídos com PBS para a concentração desejada (aqui: 2x10 7 células / ml) e corados com, por exemplo PKH26 (Sigma), um vermelho fluorescente de células vivas kit rotulagem de membrana, de acordo com os fabricantes de &quot;protocolo. Células são re-suspensas em meio de cultura celular (preferencialmente meio modificado Dulbecco águia; DMEM) para a concentração desejada para injeção (10 7 células / ml) ou a inoculação (3x10 6 células / ml). Concentrações de células diferentes são aplicadas para injectáveis ​​x inoculação de acordo com as concentrações já publicados na literatura 15-17 e nossa experiência. </li></ol> 4,2 inoculação de células para o CAM <ol><li> Anéis (~ espessura 1mm) são cortadas a partir de uma ponta da pipeta de 1ml ou um cateter venoso periférico (PVL) do tubo pelo uso de um bisturi afiado e aplicada à CAM de um E6-E14 pinto embrião ovo ex cultivadas. Nota: Tente não &quot;viu&quot; várias vezes, mas para cortar a ponta da pipeta ou tubo de cateter com um corte com um bisturi novo, muito afiada para evitar bordas afiadas sobre os anéis resultantes. Verifique os anéis sob o microscópio para arestas resultantes de micro-rachaduras. </li><li> Dependendo do tamanho dos anéis 20 l de 3x10 6 células / ml células são pipetados no total em um anel ou como volumes dividido em vários anéis. Nota: Em alguns casos, traumatismos do CAM por raspagem gentil é um pré-requisito, por exemplo, para facilitar a inoculação das células 17 e capillarisation de enxertos (veja abaixo). Se, no entanto, traumatismos do CAM não é intencional ou contra-indica, por exemplo, para estudos do potencial de invasão das células tumorais, os anéis não devem ser usadas para a inoculação, mas as células devem ser aplicados diretamente como aplicação de anéis ou anéis se pode induzir lesão micro . Se os anéis são usados, estes devem ser cortados o mais fino possível para minimizar o peso e evitar o recuo do CAM. </li></ol> Parte 5: injeção intravítrea de células <ol><li> A seringa de microlitro Hamilton é lavado várias vezes com EtOH 70% e, finalmente, com PBS estéril. </li><li> A seringa micro é preenchido com a suspensão de células preparadas manchados ou imaculada (ver parte 4.1). Nota: O local da injeção tem que ser cuidadosamente escolhidas, para não ferir os vasos sanguíneos das estruturas adjacentes CAM ou do embrião (brain!) por mais de penetração com a agulha. A injeção deve ser feita sob um binóculo dissecção. </li><li> Sob controle de microscópio, Com cuidado, mas rapidamente penetrar no CAM e camadas de olho com a agulha da seringa e continuamente injetar 10 a máxima suspensão de células 20 l (preferencialmente diluído em PBS) no vítreo do pinto embrião ovo ex cultivadas. Nota: Se o CAM não pode ser penetrada com a agulha, ele pode ser removido em um local com poucos vasos sangüíneos ou nenhuma suavemente desmanchá-lo com duas pinças. </li><li> A agulha deve permanecer 1-2 segundos dentro do olho para evitar uma perda da suspensão de células injetadas pelo vazamento. </li></ol> Parte 6: A dissecção de brotos de membros de frango <ol><li> Os ovos são retirados da incubadora após 3 a 4 dias de incubação (E3/E4 = Hamburger Hamilton (HH) stage18-23) </li><li> Ovos são rachados na borda de uma barra de agitação magnética triangular e transferido para uma placa de Petri (detalhes: consulte a Parte 2) eo embrião é dissecado dos vasos gema conectado cortando um círculo usando uma tesoura primavera. </li><li> O embrião é transferido para uma placa de Petri fresco cheio de frio, PBS estéril pelo uso de uma colher pequena de drenagem e lavada por agitação tipo. </li><li> O embrião é transferido para uma placa de Petri pequena cheia de PBS estéril e livre de membranas que envolvem, cuidadosamente as destroçar com uma pinça fina. </li><li> Brotos dos membros são destacados por pinças microcirúrgicas o mais próximo do corpo possível, apreendido e transferido para o CAM de 8-10 dias de idade anfitrião ovo de galinha ex cultivados (ver procedimento de enxerto). </li></ol> Parte 7: Preparação dos brotos dos membros do mouse <ol><li> Acasalamentos tempo grávidas são criados e na manhã do dia em que um plug vaginal é detectado em acasalar fêmeas é designada 0 dias de gestação. </li><li> A fêmea grávida, foi sacrificado por deslocamento cervical quando o desenvolvimento dos embriões chegou dia embrionário (E) 10 a 13 e fixo em uma placa de cera. </li><li> A parede abdominal é umedecido com ETOH 70%, corte ao longo da linha média e os retalhos cutâneos são fixados lateralmente por pinos. </li><li> Ambos os cornos do útero são removidos do abdômen, individual e transferidos para um copo com PBS frio. </li><li> Os embriões são separados, transferidos para uma placa de Petri e parede do útero e as membranas embrionárias são removidos cuidadosamente pelo uso de fórceps. </li><li> Brotos dos membros são cortados pelo uso de tesouras primavera ou separada por uma pinça bem como junto ao corpo possível, apreendido e transferido para o CAM de 8-10 dias de idade anfitrião ovo de galinha ex cultivados (ver procedimento de enxerto). </li></ol> Parte 8: Coleta de amostras de tumor <ol><li> Biópsias de tumores são coletados em dois tubos Eppendorf ml preenchido com meio de cultura de células tumorais específicas (aqui: médio Leibovitz) e mantidas à temperatura ambiente. </li><li> Biópsias de tumores são cortados em pedaços por 1-2 mm3 bisturis esterilizados. Nota: Se as amostras de tumor eram muito pequenos, eles podem não anexar ao CAM, se eles eram grandes demais, o CAM pode ser ferido e que o embrião pode morrer. </li><li> Um pedaço do núcleo da amostra da biópsia é enxertado na CAM de 8-10 dias de idade anfitrião ovo de galinha ex cultivados (ver procedimento de enxerto). Nota: Levando material da superfície da biópsia aumenta o risco de contaminação com músculo ou tecido conjuntivo. </li></ol> Parte 9: procedimento de enxerto <ol><li> Para enxertia de gemas membro ou tecido tumoral, o CAM totalmente desenvolvido de 8-10 dias de idade embriões de galinha cultivadas ex ovo é usado. </li><li> Os enxertos são idealmente colocado no CAM perto de uma bifurcação Y de um vaso sanguíneo. </li><li> No local da aplicação desejada, o CAM é seletivamente traumatizado por off de raspagem suave (fórceps) a parte superior peridermal da dupla camada epitelial, deixando a camada basal intacta. Nota: É essencial para evitar sangramento ou ruptura de capilares visíveis. </li><li> O enxerto é transferido para o CAM com PBS mínima anexado. Dependendo do enxerto, pode ser colocada uma ou duas vezes em um site do CAM, onde não há finais de enxerto é destinado para remover excesso de PBS e, finalmente, enxertado no local CAM preparado traumatizados. </li><li> O enxerto é agarrado por uma pinça fina e em camadas sobre a CAM. Dependendo da sensibilidade do enxerto, uma leve pressão pode ser aplicada (não é adequado para brotos dos membros) para manobrar o enxerto em um recuo resultante do CAM (adequado para amostras de tumor). Nota: Como o sistema imunológico desenvolve pinto no dia embrionário (E) 18, ex culturas xenoenxertos ovo não deve ser prolongada para além E17 como o anfitrião embriões de galinha morrem. É importante ter CAMs anfitrião disponíveis, respectivamente embriões de galinha ovo ex cultivadas, para coincidir com uma fonte de tecidos de uma doadora de sua escolha. </li></ol> Parte 10: Re-enxerto <ol><li> O embrião de galinha hospedeiro é morto por decapitação. </li><li> A CAM comenxerto em anexo é removido por um corte circular com uma tesoura apontada e transferidos para uma placa de Petri cheia de PBS. </li><li> CAM excessiva é cortado a partir do enxerto com tesoura de primavera, exceto para o local de ligação anterior. </li><li> Em caso de amostras maiores de tumores, o enxerto é cortado em metades ou vários pedaços menores e re-enxertados com o gume de frente para o CAM nova do anfitrião segundo. </li></ol> Parte 11: Resultados Representante <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Shell-less cultura de frango Embriões de galinha de diferentes estágios de desenvolvimento cultivadas ex ovo em placas de Petri. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Angiogênese ensaio Ex ovo CAM Ovos de galinha fertilizados foram incubadas horizontalmente a 37 ° C e umidade de 60-62% e rachada em placas de Petri no dia embrionárias 4 (E4). De incubação foi mantido nas mesmas condições. No E10 estéril papéis de filtro (5,5 mm de diâmetro) foram mergulhadas em cima do CAM e encharcado ou com 5 mL de PBS ou 3 mg angiotropin6 nativa. Capilares mostraram alinhamento óbvia para o papel embebido angiotropin filtro em E14. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Ovo Ex enxerto de brotos dos membros Brotos dos membros do pinto (E3/E4) e mouse (E13) foram enxertados na CAM de culturas shell-less frango. Vasos sanguíneos do CAM entrou no brotos dos membros após dois dias. O desenvolvimento de brotos dos membros continuaram nestas culturas ex ovo alcançando um estágio falange dois no pinto e exibindo redução da teias interdigital em brotos dos membros murino. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Inoculação in ovo Ex de amostra de tumor Uma amostra de biópsia de carcinoma da bexiga foi inoculado para o CAM de 10 dias de idade pinto embrião ovo ex cultivadas. Depois de dois dias em cultura, o espécime do tumor foi conectado à vasculatura CAM e após 7 dias, os vasos sangüíneos múltiplos entrar no enxerto foi observada.

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	<li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+long-term+cultivation+of+chicken+embryos.">A simple procedure for long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).</li><li>Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shell-less+culture+of+the+chick+embryo+as+a+model+system+in+the+study+of+development+neurobiology.">Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of development neurobiology.</a> Neuroanatomy. 3, 8-11 (2004).</li><li>Deryugina, E. I., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+models+to+quantify+angiogenesis+induced+by+inflammatory+and+tumor+cells+or+purified+effector+molecules.">Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules.</a> Methods Enzymology. 444, 21-44 (2008).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis.">Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> Int. Rev. Cell Mol. Biol. 270, 181-224 (2008).</li><li>H&#246;ckel, M., Sasse, J., Wissler, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+monocyte-derived+angiogenic+substance+(angiotropin)+stimulates+migration,+phenotypic+changes,+and+"tube+formation"+but+not+proliferation+of+capillary+endothelial+cells+in+vitro.">Purified monocyte-derived angiogenic substance (angiotropin) stimulates migration, phenotypic changes, and "tube formation" but not proliferation of capillary endothelial cells in vitro.</a> J. Cell Physiol. 133, 1-13 (1987).</li><li>Wissler, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+blood+vessel+patterns+by+Angio+Morphogens+[Angiotropins].">Engineering of blood vessel patterns by Angio Morphogens [Angiotropins].</a> Materialwiss. Werkstofftech. 32, 984-1008 (2001).</li><li>Kistler, H. B. . J. r. .., LaVail, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+of+horseradish+peroxidase+into+the+optic+nerve+after+vitreal+or+vascular+injections+in+the+developing+chick.">Penetration of horseradish peroxidase into the optic nerve after vitreal or vascular injections in the developing chick.</a> Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 20, 705-716 (1981).</li><li>Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Change+in+embryonic+eye+size+and+retinal+cell+proliferation+following+intravitreal+injection+of+glycosaminoglycans.">Change in embryonic eye size and retinal cell proliferation following intravitreal injection of glycosaminoglycans.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 3289-3298 (2008).</li><li>Oppitz, M., Busch, C., Shriek, G., Metzger, M., Just, L., Drews, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-malignant+migration+of+B16+mouse+melanoma+cells+in+the+neural+crest+and+invasive+growth+in+the+eye+cup+of+the+chick+embryo.">Non-malignant migration of B16 mouse melanoma cells in the neural crest and invasive growth in the eye cup of the chick embryo.</a> Melanoma Res. 17, 17-30 (2007).</li><li>Uchibayashi, T., Egawa, M., Nakajima, K., Hisazumi, H., Tanaka, M., Endo, Y., Sasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+tumour+cell+lines+implanted+onto+the+chorioallantoic+membrane+of+chick+embryo+to+anticancer+agents+in+combination+with+hyperthermia.">Responses of tumour cell lines implanted onto the chorioallantoic membrane of chick embryo to anticancer agents in combination with hyperthermia.</a> Urol. Res. 20, 237-239 (1992).</li><li>Demir, R., Naschberger, L., Demir, I., Melling, N., Dimmler, A., Papadopoulus, T., Sturzl, M., Klein, P., Hohenberger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+generates+a+more+invasive+phenotype+of+tumour+cells:+an+in+vivo+experimental+setup+based+on+the+chorioallantoic+membrane.">Hypoxia generates a more invasive phenotype of tumour cells: an in vivo experimental setup based on the chorioallantoic membrane.</a> Pathol. Oncol. Res. , (2008).</li><li>Kunzi-Rapp, K., Genze, F., Kufer, R., Reich, E., Hautmann, R. E., Gschwend, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chorioallantoic+membrane+assay:+vascularized+3-dimensional+cell+culture+system+for+human+prostate+cancer+cells+as+an+animal+substitute+model.">Chorioallantoic membrane assay: vascularized 3-dimensional cell culture system for human prostate cancer cells as an animal substitute model.</a> J. Urol. 166, 1502-1507 (2001).</li><li>Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+of+organs+and+tissues+to+the+chorioallantoic+membrane+of+the+embryonic+chick.">Grafting of organs and tissues to the chorioallantoic membrane of the embryonic chick.</a> TCA Manual. 4 (3), 881-883 (1978).</li><li>Kunzi-Rapp, K., Kaskel, P., Steiner, R., Peter, R. U., Krahn, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+blood+levels+of+human+S100+in+melanoma+chick+embryo+xenografts'+circulation.">Increased blood levels of human S100 in melanoma chick embryo xenografts' circulation.</a> Pigment Cell Res. 14, 9-13 (2001).</li><li>McFall, R. C., Sery, T. W., Makadon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+new+continuous+cell+line+derived+from+a+human+retinoblastoma.">Characterization of a new continuous cell line derived from a human retinoblastoma.</a> Cancer Research. 37, 1003-1010 (1977).</li><li>Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+effect+of+matrix+metalloproteinase+down-regulation+on+vascular+intravasation+and+metastasis+of+human+fibrosarcoma+cells+selected+in+vivo+for+high+rates+of+dissemination.">Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination.</a> Cancer Research. 65, 10959-10969 (2005).</li><li>Kim, J., Kovalski, K., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=requirement+for+specific+proteases+in+cancer+cell+intravasation+as+revealed+by+a+novel+semiquantitative+PCR-based+assay.">requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay.</a> Cell. 94, 353-362 (1998).</li></ol>

Inovador ou apenas um outro protocolo cultura pinto? Protocolos com o ex-shell-less cultura 04/01 as taxas de sobrevivência total da embriões de galinha eram baixos, por exemplo, ca. 30% 1. O requintado ex protocolo cultura ovo descrito neste artigo de vídeo, por outro lado, permite taxas de sobrevivência superiores a 50%. Comparado ao clássico em culturas ovo cultura ovo ex de embriões de galinha significativamente fac...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fertilized Eggs</td>
<td>Animal</td>
<td>S&ouml;ries Trockels, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mice</td>
<td>Animal</td>
<td>Charles Rivers Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator Type 3000 with rotating egg tray</td>
<td>Tools</td>
<td>Siepmann GmbH Germany</td>
<td>9503</td>
<td>Maintain at 37&deg;C with relative humidity set above 60%</td>
</tr>
<tr>
<td>Egg incubator BSS 160</td>
<td>Tools</td>
<td>Grumbach, Germany</td>
<td>8101</td>
<td>Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PBS should be cold (&gt; 4&deg;C) and sterile
</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco's modified eagle's medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 6429</td>
<td>DMEM culture medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Leibovitz's L-15 Medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31415-029</td>
<td>here: collection medium for tumor samples</td>
</tr>
<tr>
<td>Tumor cell -specific medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz's Medium or Dulbecco's modified eagle's medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 &mu;M insulin</td>
</tr>
<tr>
<td>70% EtOH</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic stir bar, triangled 80 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>442-0391</td>
<td>A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #5 </td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #7</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11271-30</td>
<td>curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Spring scissors, straight, 8cm</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>fine, small straight blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine Iris scissors, straight</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14094-11</td>
<td>Use to cut our the CAM</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard scissors, straight, sharp/blunt</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14007-14</td>
<td>Use for decapitation or cervical dislocation</td>
</tr>
<tr>
<td>microliter syringe 1702 TLLX, 25 &mu;l</td>
<td>Tool</td>
<td>Hamilton</td>
<td>80222</td>
<td>Use for injection into the vitreous</td>
</tr>
<tr>
<td>Hamilton 33-G needle (15 mm)</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>18073-15</td>
<td>Use for injection into the vitreous</td>
</tr>
<tr>
<td>Sterile scalpels</td>
<td>Tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use for dissecting tumor samples</td>
</tr>
<tr>
<td>Small drain spoon</td>
<td>Tool</td>
<td>Geuder, Germany</td>
<td>15758</td>
<td>Use to transfer of small chick embryos</td>
</tr>
<tr>
<td>Wax board with fixing pins</td>
<td>Tool</td>
<td>Self made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use to fix of animals for dissection</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dishes 60 x 15 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Greiner</td>
<td>628102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petri dishes 92 x 16 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>82.1472</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Petri dish 100 x 20 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Greiner</td>
<td>664160</td>
<td>extra deep, with spacers for ventilation</td>
</tr>
<tr>
<td>Beaker</td>
<td>Tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>300-600 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>FALCON tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>15 ml and 50 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1.5 ml and 2 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>1ml pipette tips</td>
<td>Tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use to cut plastic rings for application of substances / cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Peripheral venous catheter (PVL)</td>
<td>Tool</td>
<td>Viggo&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipettes and tips</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf / Abimed</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter</td>
<td>Tool</td>
<td>Schleicher &amp; Schuell</td>
<td>311643</td>
<td>Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper</td>
</tr>
<tr>
<td>PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>santec-medical</td>
<td>REF 277, LOT 832/511-1</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Kollidon 17 PF</td>
<td>Reagent</td>
<td>BASF</td>
<td>S30200</td>
<td>mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagen Biomatrix TissuDura</td>
<td>Tool</td>
<td>Baxter Healthcare S.A.</td>
<td>REF B2246000999999</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Round glass cover slips, 11 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Assistent Germany</td>
<td>1001/0011</td>
<td>Carrier; causes false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine Collagen Sponge</td>
<td>Tool</td>
<td>Wyeth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Resodont Absorbable Collagen Membrane</td>
<td>Tool</td>
<td>Resorba Woundcare Germany</td>
<td>LOT 280303</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-Woven Swabs</td>
<td>Tool</td>
<td>Fink &amp; Walter GmbH</td>
<td>REF 328132</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

chick ex ovo culture and ex ovo cam assay: how it really works

Ovos de galinha na fase inicial da criação de animais estão entre in vitro e em sistemas in vivo e proporcionar um ambiente de teste vascular não só para estudar a angiogênese, mas também para estudar tumorigênese. Depois que o pintinho membrana corioalantóide (CAM) tem desenvolvido, sua rede de vasos sanguíneos podem ser facilmente acessados, manipulados e observados e, portanto, oferece um cenário ideal para ensaios de angiogênese. Como o sistema linfático não está totalmente desenvolvido até os estágios finais de incubação, o embrião de galinha serve como hospedeiro natural imunodeficientes capaz de sustentar os tecidos enxertados e células sem restrições espécie-específicos. Além de nutrir desenvolvimento allo e xenotransplantes, o CAM rede dos vasos sanguíneos fornece um ambiente único de apoio para intravasation célula tumoral, disseminação e prisão vascular e um repositório onde as células preso extravasar para formar micro focos de metástase. Para fins experimentais, na maioria dos estudos recentes, a CAM foi exposta pelo corte de uma janela através da casca do ovo e experimentos foram realizados em ovo, resultando em limitações significativas na acessibilidade do CAM e possibilidades para a observação e documentação fotográfica de efeitos. Quando shell-less culturas do embrião de galinha foram usadas 1-4, não foram fornecidos detalhes experimentais e, se publicado em tudo, as taxas de sobrevivência dessas culturas foram baixas. Nós refinou o método de cultura ovo ex de embriões de galinha significativamente através da introdução de uma extrusão racionalmente controlada do conteúdo do ovo. Estas culturas ex ovo aumentar a acessibilidade do embrião CAM e pinto, permitindo fácil na documentação vivo de efeitos e facilitar a manipulação experimental do embrião. Isso permite que a aplicação bem sucedida de um grande número de questões científicas: (1) Como um ensaio de angiogênese melhorou 5,6, (2) um conjunto experimental para injectáveis ​​facilitado no vítreo do embrião olho pinto 7-9, (3) como um ambiente de teste para a divulgação e intravasation dispersos de células tumorais de linhas celulares estabelecidas inoculados no CAM 10-12, (4) como um sistema melhorado manutenção para o transplante bem sucedido e cultura de brotos de membros de frango e camundongos, bem como 13 (5 ) para enxertia, propagação e re-enxerto de tecido de tumores sólidos primários obtidos de biópsias na superfície do CAM 14. Neste artigo descrevemos o vídeo estabelecimento de uma cultura refinada pinto ex ovo e ensaio CAM com taxas de sobrevida em 50%. Além disso, fornecemos uma demonstração passo a passo da aplicação bem sucedida da cultura ex ovo para um grande número de aplicações científicas. Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, e Sebastian Gustmann contribuíram igualmente para este estudo.

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Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

O filhote corioalantóicas membrana (CAM) é único, um ambiente de cultura naturalmente imunodeficientes apoio para estudar a angiogênese e tumorigênese. Este artigo vídeo demonstra as diferentes etapas no pinto<em&gt; Ex ovo</emCultura&gt;, aplicação de substâncias potencialmente angiogênicos e inoculação bem-sucedida de células tumorais e tecidos na superfície do CAM.

Pintinho Ex ovo Cultura e Ex ovo CAM Ensaio: como ele realmente funciona

Chicken eggs in the early phase of breeding are between in vitro and in vivo systems and provide a vascular test environment not only to study ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

48.5K visualizações.  University of Duisburg-Essen. O filhote corioalantóicas membrana (CAM) é único, um ambiente de cultura naturalmente imunodeficientes apoio para estudar a angiogênese e tumorigênese. Este artigo vídeo demonstra as diferentes etapas no pinto Ex ovo, aplicação de substâncias potencialmente angiogênicos e inoculação bem-sucedida de células tumorais e tecidos na superfície do CAM.

Vídeo: Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Biologia

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking axonal projection of spinal interneurons in vertebrates, germ line-targeted reporter genes yield bilaterally symmetric labeling. Therefore, it is hard to distinguish between the ipsi- and contra-laterally projecting axons. Unilateral electroporation into the chick neural tube provides a useful means to restrict expression of a reporter gene to one side of the central nervous system, and to follow axonal projection on both sides 1 ,2-5. This video demonstrates first how to handle the eggs prior to injection. At HH stage 18-20, DNA is injected into the sacral level of the neural tube, then tungsten electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator. The egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development. Three days later (E6) the spinal cord is removed as an open book preparation from embryo, fixed, and processed for whole mount antibody staining. The stained spinal cord is mounted on slide and visualized using confocal microscopy.

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

This video demonstrates how to visualize axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the embryonic chick spinal cord utilizing in ovo electroporation of reporter genes under the control of specific enhancer elements.

Decifrando Pathways Axonal dos Grupos geneticamente definidos de neurônios no tubo Neural Utilizando Pintainho In ovo Eletroporação

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Um Ex-ovo Sistema de Cultura de embriões de frango Indicado para aplicações de imagem e Microcirurgia

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex Vivo de Cultura Primária células epiteliais trompa de Falópio

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

Em Eletroporação Ovo na retina de pinto embrionário

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

Transferência de Embriões em Gene de frango por mais velhos<em&gt; Ovo ex</em&gt; Eletroporação

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de Cultura para o Rato coração embrionário

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Cultura do Rato Embryonic pele e Live-imaging de Migração melanoblasto

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.