Cultura Primária de Baixa Densidade Fácil e Reprodutível usando Estoque Congelado de Neurônios Embrionários do Hipocampo

Os estoques congelados de neurônios embrionários de ratos estão prontos para uso, e nenhuma técnica avançada é necessária para a cultura das células. Esta técnica é muito fácil e você não precisa de nenhuma permissão para experimentação animal, organização de animais grávidas cronometrados ou dissecação de embriões. Os neurônios podem ser cultivados em outros vasos de cultura e aplicados para outros tipos de experimentos.

Por exemplo, placas de matriz de microeletrodos para experimentos eletrofisiológicos. Comece revestindo uma microplaca de 96 poços com 100 microlitros de poli-L-lisina por poço. Em seguida, incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius.

No final da incubação, remova a solução de poli-L-lisina. Lave as placas duas vezes com água esterilizada e uma vez com meio de cultura fresco e sem suplementos. Coloque as placas para secar.

As placas secas podem ser embrulhadas e armazenadas por até um mês a quatro graus Celsius. Para iniciar a semeadura celular, adicione 50 microlitros do meio de cultura a cada poço nas placas revestidas. Encha os poços periféricos com 200 microlitros de água esterilizada e incube a placa por uma hora a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%.

Remova o frasco para injetáveis de crio de neurónio do depósito de azoto líquido e coloque-o num bloco de calor de 37 graus Celsius para descongelar parcialmente o seu conteúdo. Usando uma pipeta de um mililitro com uma ponta de furo larga, transfira lentamente o conteúdo dos frascos para injetáveis gota a gota para um tubo estéril de 50 mililitros. Lave o frasco para injetáveis de crio vazio com um mililitro de meio de cultura à temperatura ambiente.

Transfira a solução de enxágue para o tubo de 50 mililitros que contém a suspensão celular. Em seguida, adicione nove mililitros do meio de cultura de temperatura ambiente gota a gota no tubo de 50 mililitros, compondo o volume para 11 mililitros. Depois de contar as células usando um hemocitômetro, transfira a suspensão celular para um reservatório.

Agora, usando uma pipeta multicanal com pontas de furo largo, dispense a suspensão celular com uma contagem final de 1,0 vezes 10 para as quatro células por poço na placa revestida de 96 poços. Incubar os neurônios por uma a duas horas a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono. Em seguida, substitua o meio de cultura por 100 microlitros de meio de cultura pré-aquecido e incube novamente nas mesmas condições.

Após quatro dias in vitro, adicione citosina beta-D-arabinofuranoside na concentração final de 0,2 micromolar por poço para reduzir o crescimento de células gliais. Coloque a placa de volta na incubadora. Após 21 dias in vitro, trate as células com as drogas de interesse.

Para manter um controle positivo, trate as células com 100 glutamato micromolar por poço por 10 minutos a 37 graus Celsius antes da fixação. Antes de realizar estudos imunocitoquímicos, fixe as células por 20 minutos, substituindo a solução de cultura por 100 microlitros de paraformaldeído em cada poço. Após a fixação, lave os poços duas vezes com 250 microlitros de solução salina tamponada com fosfato por poço por cinco minutos cada.

No presente estudo, os neurônios foram desenvolvidos normalmente sem troca do meio de cultura por três semanas. A imuno-histoquímica revelou espinhos dendríticos positivos para drebrina ao longo dos dendritos positivos para MAP2. A redução dose-dependente das densidades do cluster de dretrina contra a estimulação do glutamato foi observada.

O transplante da suspensão celular antes que ela se torne muito quente é muito importante. A adição gota a gota de meio de cultura também é crucial para evitar mudanças repentinas na osmolaridade.