O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o desenvolvimento de neuroferas a partir de neurônios hipocampais primários mistos e corticais isolados do embrião de ratos E14-E16 Sprague Dawley, a fim de oferecer uma plataforma robusta e de baixo custo para estudar o efeito de vários leads neuroterapêuticos. Como você sabe, esse cérebro é uma complexa rede de neurônios associados com um grande número de células de suporte. Para entender a função cerebral, muitas vezes a maioria das pesquisas é reintratada a partir de experimentos in vitro, que envolve linhas celulares derivadas de linhagem neural comercialmente disponíveis.
No entanto, essas linhas celulares são linhas celulares transformadas que sofrem de variações genotipípicas e fenotípicas. Para resolver essas questões, a cultura primária dos neurônios é a abordagem adequada. Aqui, ilustramos um protocolo simples e econômico para cultivar neurônios primários e construímos uma plataforma de triagem robusta para várias terapêuticas neurais.
A principal vantagem deste protocolo é que apenas modulando as densidades de revestimento celular, podemos mostrar duas plataformas de cultura de neurônios contrastantes onde a baixa densidade leva à cultura de neurônios primários prolongada, e a alta densidade gera neuroesferas espontâneas. Pegue duas placas de 24 poços. Um para alta densidade, e outro para revestimento de baixa densidade.
Transfira 12 mm de tampas de vidro estéreis nas placas de 24 poços. Despeje 300 microliters de solução PDL em cada um dos poços de uma forma que cubra totalmente a superfície de toda a mancha de cobertura. Prepare a solução PDL com uma concentração de 0,1 mg/mL em água deionizada.
Enrole as placas com folhas de alumínio para evitar a secagem e mantenha-as na incubadora de CO2 durante a noite. No dia seguinte, antes de emplacamento, aspire a solução PDL. Lave corretamente com água estéril por duas a três vezes.
Em seguida, adicione a mídia de chapeamento e devolva as placas à incubadora até chapeamento. Sacrifique um rato Sprague-Dawley grávida E14-E16 cronometrado, faça um corte em forma de V na área abdominal usando fórceps estéreis e um par de tesouras sem corte. Remova todos os fetos e coloque-os cuidadosamente na placa de petri com solução HBSS fria.
Retire os embriões dos sacos embrionários e lave-os cuidadosamente em uma placa de petri separada em HBSS fresco e frio. Decapite a cabeça com a ajuda de uma tesoura estéril. Transfira as cabeças nas placas estéreis de 90 mm de petri com HBSS frio.
Sob o microscópio estéreo, segure a cabeça da região do focinho com as fórceps serrilhadas estéreis, e retire o cérebro cortando a pele e o crânio abertos. Remova todas as meninges dos hemisférios e do cérebro médio segurando o tronco cerebral. Remova cuidadosamente os hemisférios intactos, assemelhando-se a tampas de cogumelo que contém o hipocampo e o córtex.
Colete os hemisférios contendo córtex e hipocampo intacto em um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de mídia de dissociação. Permita que os tecidos coletados se acalmem e aspirem o meio de dissociação, deixando de 5 a 10% do meio nele. Novamente, adicione 10 mL de meio de dissociação fresco a ele, e repita esta etapa duas vezes.
Adicione 4,5 mL de meio de dissociação e 0,5 mL de solução trypsin-EDTA. Mantenha-o na incubadora a 37 graus Celsius por 20 minutos para que a digestão prossiga. Aspire o médio e lave com 10 mL de meio de dissociação e meio de revestimento, consecutivamente.
Resuspensá-los em 2,5 mL de meio de revestimento. Mantenha um prato estéril de 90 mm sobre a tampa invertida do prato e despeje-o na base de 90 mm prato estéril. Titular os tecidos digeridos na base do canto do prato, utilizando 1000 ponta de pipeta microliter, de modo a ocupar o menor volume.
Passe a suspensão celular obtida através do coador de células de 70 micrômetros, excluindo quaisquer pedaços de tecido. Determine a densidade de células viáveis usando a exclusão de corante azul trypan, e conte o número de células em um contador celular automatizado. Diluir o número de células obtidas de forma aplacar 1,5 em 10 para a potência de 5 células por mL para chapeamento de alta densidade, e 20.000 células por mL para chapeamento de baixa densidade em dois tubos separados contendo 30 mL de meio de revestimento.
Aspire o meio de revestimento previamente adicionado e a placa 500 microliters de células dispersas em meio de revestimento em cada poço. Depois disso, devolva as placas à incubadora por quatro horas. Quatro horas após o revestimento, examine as células para adesão sob o microscópio.
Após quatro horas de revestimento, tanto em placas de alta e baixa densidade, os neurônios mostram boa aderência às placas. Substitua o meio em cada poço por 500 microliters de meio de manutenção fresco, e incuba-o em uma incubadora a 37 graus Celsius. Temos que cultivar esses neurônios banhados em alta e baixa densidade.
Enquanto os neurônios banhados de baixa densidade podem ser usados para culturas prolongadas, até 30 dias, alterando o meio de manutenção duas vezes por semana, os neurônios banhados de alta densidade começam a gerar espontaneamente neuroesferas, que vieram um dia depois que mantivemos em placa de fixação ultra-baixa. Após 24 horas de revestimento, tanto neurônios banhados de alta e baixa densidade são observados para apresentar morfologia saudável. Uma imagem de contraste de fase dos neurônios banhados de baixa densidade, cultivados por cerca de sete dias, é exibida aqui.
Os neurônios apresentam morfologia saudável, podendo ser mantidos até 30 dias com roteamentos mais vigorosos e interconexões. O diagrama da barra aqui mostra cerca de 90% de viabilidade dos neurônios banhados de baixa densidade mesmo após 30 dias de cultura, conforme determinado pelo ensaio MTT. Os neurônios primários aqui foram caracterizados pela imunostenção com Tuj 1, um marcador de neurônios diferenciados, e tau, um marcador de axônios neuronais.
A pureza dos neurônios é confirmada pela ausência de manchas em marcadores não neuronais GFAP para astrócitos e O4 para oligodendrócitos. Em todos os estudos de caracterização, núcleos foram manchados com Hoechst 33258. Aqui, as células semeadas de baixa densidade foram manchadas com o marcador astrócito GFAP e o marcador neuronal Tuj 1 para verificar a pureza da cultura até sete dias.
Observa-se que este protocolo suporta o crescimento preferencial dos neurônios sobre os astrócitos, conforme indicado através da análise quantitativa. Núcleos foram manchados com Hoechst 33258. Da mesma forma, nas células semeadas de alta densidade, os astrócitos foram manchados com GFAP e neurônios por Tuj 1.
Aqui, na análise quantitativa, cerca de 17% de astrócitos são observados em comparação com 83% dos neurônios. Os núcleos foram manchados com Hoechst 33258. Após sete dias, formam espontaneamente múltiplas neurosferas nos neurônios de alta densidade.
Por volta do oitavo ao décimo dia de cultura, nos neurônios banhados de alta densidade, as neurosferas começam a formar grandes projeções e pontes consistindo de extensões gliais radiais. As flechas negras indicam a ponte entre duas neurosferas recém-formadas. Ensaios de células vivas e mortas foram realizados nas neurosferas por 15 dias.
Na densa mancha de Calcein AM, sem absolutamente nenhuma coloração de iodeto propidium, indica quase 100% de viabilidade das neurosferas na cultura. O gráfico de linha aqui indica uma expansão no tamanho das neurosferas com a passagem de número de dias. Esta imagem excessivamente manchada da neurosfera indica uma rica população de células progenitoras neurais através do aumento da expressão dos marcadores NPC Nestin e Tuj 1.
As neuroesferas aqui mostram altas quantidades de astrócitos marcadas pela forte expressão de GFAP, acompanhadas por uma expressão ainda maior do marcador neuronal Tuj 1. Os núcleos foram manchados com Hoechst 33258. Então eu acho que nosso protocolo é bastante emocionante e interessante, considerando o fato de que a partir de uma única estratégia somos capazes de obter duas plataformas: uma 2-D e outra 3D.
E esta será uma ótima plataforma para triagem de diferentes trilhas neuroterapêuticas. Então eu acho que é realmente muito útil para todos os neurocientistas. Outro aspecto importante é que as neurosferas em que optamos são extremamente ricas em células progenitoras neurais, os NPCs.
E eles podem ser usados para diferenciá-los em neurônios e linhagens não neuronais. Então, eu sinto que se, realmente, as pessoas podem dominar essa técnica tirando ajuda deste vídeo, vai ser realmente útil para todos. Obrigado.
