Assim, as células progenitoras interagem com o ambiente para manter a homeostase tecidual. E usando este protocolo podemos começar a entender como os fibroblastos afetam o comportamento das células progenitoras esofágicas. O sistema de co-cultura utiliza primeiramente células isoladas que mimetizam o nicho progenitor esofágico normal.
A limpeza dos organoides antes da obtenção de imagens permite a análise das interações celulares e da morfologia organoide. Este método pode ser aplicado a organoides esofágicos humanos. Por exemplo, usando materiais de pacientes saudáveis ou com câncer.
Ao fazer isso, podemos obter insights sobre a função específica dos fibroblastos associados ao câncer. A dissociação de células epiteliais e estromais é fundamental para a obtenção de organoides viáveis. Sob digestão resultará em um baixo rendimento celular, onde a digestão excessiva reduzirá a viabilidade celular e a capacidade de formação de organoides.
Para começar, remova mecanicamente a muscular externa do esôfago usando um microscópio de dissecção e pinças. Segure a extremidade distal do esôfago dissecado usando uma pinça e use a outra pinça para agarrar e puxar o músculo da extremidade distal para a proximal do esôfago. Retire e descarte a camada muscular.
Para abrir o esôfago longitudinalmente, segure uma extremidade do esôfago e insira a bola da tesoura da mola de microdissecção no lúmen para evitar danos teciduais. Abra o esôfago segurando na extremidade e coloque-o em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro ou uma placa de 24 poços. Submergir o esôfago aberto em 0,5 miligramas por mililitro de termolisina em HBSS e incubar a 37 graus Celsius em um agitador balancim por 15 minutos.
Depois de remover o esôfago da solução de termolisina, separe cuidadosamente o epitélio esofágico do estroma. Transfira a camada epitelial e estromal para dois tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mililitro com 200 microlitros de solução de dissociação em HBSS e coloque-os no gelo. Pique o epitélio esofágico usando um bisturi afiado e colete o tecido picado da placa de Petri com 200 microlitros de solução de dissociação.
Transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicionar 800 microlitros de solução fresca de dissociação e colocar o tubo com a camada epitelial picada em um agitador balancim a 37 graus Celsius por 60 minutos. Pipetar a solução para cima e para baixo aproximadamente 20 vezes usando uma ponteira de pipeta de 200 microlitros a cada 15 minutos.
Cortar a camada estromal em pedaços finos em um tubo de 1,5 mililitro contendo 200 microlitros de solução de dissociação usando tesoura de dissecção e adicionar 800 microlitros de solução fresca de dissociação. Coloque o tubo em um agitador basculante a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos de incubação para solução estromal e 60 minutos de incubação para solução epitelial, pipetar a solução para cima e para baixo por mais 20 vezes.
Passe a solução estromal através de um filtro de células de 70 micrômetros e a solução epitelial através de um filtro de células de 40 micrômetros em novos tubos de microcentrífuga de 1,5 milímetros. Centrifugar a 300G por 10 minutos a quatro graus Celsius e descartar o sobrenadante removendo o excesso de líquido com uma pipeta de um mililitro. Ressuspender o pellet em 200 microlitros de mistura de anticorpos.
Após transferir a mistura para um tubo de citometria de fluxo, incubar as células por 30 minutos a quatro graus Celsius. Adicione três mililitros de FBS a 1% e centrifugar novamente por cinco minutos. Em seguida, ressuspenda as células em um mínimo de 200 microlitros de 1% FBS.
Adicione um a 10.000 marcadores de coloração de células mortas diluídas, cinco minutos antes da triagem por fax para isolar as células vivas. Misture as células epiteliais e fibroblastos classificados em uma proporção de um para dois em um tubo. Depois de centrifugar a 300 G por cinco minutos, descarte o sobrenadante retirando-o cuidadosamente com uma pipeta de 200 microlitros.
Lave as células uma vez, ressuspendendo o pellet em meio organoide básico frio e centrifugando novamente por cinco minutos. Coloque as células no gelo e descarte o sobrenadante, retirando-o cuidadosamente com uma pipeta de 200 microlitros. Ressuspenda as células em 10 microlitros de mistura de matriz por cúpula e coloque o tubo novamente no gelo.
Pegue a placa de 48 poços pré-aquecida da incubadora de 37 graus Celsius e faça uma cúpula matricial por poço. Usando uma pipeta de 20 microlitros, adicionar 200 microlitros de meio pré-aquecido, ER baixo para as cúpulas matriciais contendo co-culturas organoides e meio ENR para as respectivas cúpulas matriciais contendo apenas organoides epiteliais. Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
E nos dois primeiros dias, complementar o meio com 10 inibidores de rocha micromolar. Retire o meio organoide e adicione 200 microlitros de PBS gelado às cúpulas da matriz. Depois de colocar a placa no gelo por cinco a 10 minutos, pipetar para cima e para baixo e transferir a solução para um tubo não aderente de 0,6 mililitro.
Centrifugar logo por 30 a 60 segundos a 100G para deixar os organoides se acomodarem no fundo. Depois de remover o excesso de líquido, adicione PBS gelado ao tubo e centrifugue novamente por 30 a 60 segundos. Retire o excesso de líquido como mostrado anteriormente e fixe o organoide com 200 microlitros de formaldeído frio a 4% em solução de PBS por 30 minutos no gelo.
Coloque o tubo na vertical para deixar o organoide afundar e remova o formaldeído. Adicione 500 microlitros de PBS frio para lavar o formaldeído restante. Depois de remover o excesso de PBS, adicione 500 microlitros de tampão de bloqueio.
Coloque o tubo em um agitador balancim por 60 minutos à temperatura ambiente. Remova o tampão de bloqueio e ressuspenda os organoides em 200 microlitros de tampão de bloqueio com anticorpos primários. Coloque os organoides novamente em um agitador de balancim durante a noite a quatro graus Celsius.
Remova a mistura primária de anticorpos e lave os organoides usando 500 microlitros de Triton X 100 a 0,02% em PBS por 60 minutos à temperatura ambiente. Repita isso três vezes. Da mesma forma, remova o tampão de lavagem e adicione 200 microlitros de anticorpo secundário conjugado de fluorescência no tampão de bloqueio durante a noite a quatro graus Celsius.
Relave os organoides usando 0,02% de Triton X 100 em PBS seguido de 500 microlitros de PBS. Depois de remover todo o excesso de líquido, adicione 10 microlitros de solução de limpeza aos organoides e incube por 15 minutos à temperatura ambiente. Coloque um espaçador de quatro poços adesivo de dupla face de 0,05 milímetro em uma lâmina de microscópio.
Adicione os 10 microlitros de solução de limpeza com os organoides em um poço e coloque uma tampa em cima do espaçador. Adquirir imagens utilizando um sistema de microscopia confocal. As células progenitoras esofágicas são classificadas com base em sua alta expressão integrada de beta quatro e e-caderina.
O gráfico representativo de citometria de fluxo do isolamento de células epiteliais mostra a porcentagem de células vivas de todas as células isoladas. A porcentagem de células progenitoras de integrina beta quatro e e-caderina isoladas de todas as células vivas é mostrada aqui. Os gráficos de citometria de fluxo mostrados aqui representam a porcentagem de fibroblastos isolados DPP4+ e receptores Pdgf alfa positivos.
As imagens de campo brilhante com os organoides co-cultivados com fibroblastos positivos para BEGFP do receptor Pdgf alfa H2 mostram o sinal nuclear EGFP. As imagens de campo brilhante de toda a cúpula matricial no sexto dia são mostradas aqui. A eficiência de formação de organoides é apresentada por esta imagem gráfica.
Cada ponto representa uma cúpula matricial, e a barra representa a média de todos os pontos por condição. As imagens de campo brilhante e fluorescentes do sexto dia de co-cultura de organoides com fibroblastos alfa positivos para o receptor Pdgf são mostradas aqui. As imagens de montagem inteira dos organoides co-cultivados mostram superfícies 3D dos organoides com fibroblastos positivos para vimentina envolvidos e em contato próximo com o organoide.
A coloração de montagem completa de organoides mono e co-cultivados com fibroblastos alfa positivos para receptor Pdgf revela populações de células basais e suprabasais distintas. A eficiência de formação do organoide, bem como o tamanho do organoide, são influenciados pelo fibroblasto incluído na co-cultura. Variações e resultados são esperados ao usar diferentes subpopulações de fibroblastos.
A mesma estratégia pode ser empregada para caracterizar fibroblastos associados a tumores em camundongos e humanos.
