Caratterizzazione funzionale e visualizzazione di fibroblasti esofagei mediante co-colture organoidi

Quindi le cellule progenitrici interagiscono con l'ambiente per mantenere l'omeostasi dei tessuti. E usando questo protocollo possiamo iniziare a capire come i fibroblasti influenzano il comportamento delle cellule progenitrici dell'esofago. Il sistema di co-coltura utilizza in primo luogo cellule isolate che imitano la normale nicchia progenitrice esofagea.

La pulizia degli organoidi prima dell'imaging consente l'analisi sia delle interazioni cellulari che della morfologia degli organoidi. Questo metodo potrebbe essere applicato agli organoidi esofagei umani. Ad esempio utilizzando materiali provenienti da pazienti sani o oncologici.

In tal modo, possiamo ottenere informazioni sulla funzione specifica dei fibroblasti associati al cancro. La dissociazione delle cellule epiteliali e stromali è fondamentale per ottenere organoidi vitali. Sotto digestione si tradurrà in una bassa resa cellulare, dove la digestione eccessiva ridurrà la vitalità cellulare e la capacità di formazione di organoidi.

Per iniziare, rimuovere meccanicamente la muscolaris esterna dell'esofago usando un microscopio a dissezione e una pinza. Tenere l'estremità distale dell'esofago sezionato usando un paio di pinze e usare l'altra pinza per afferrare e tirare il muscolo dall'estremità distale all'estremità prossimale dell'esofago. Rimuovere e scartare lo strato muscolare.

Per aprire l'esofago longitudinalmente, tenere un'estremità dell'esofago e inserire la sfera delle forbici a molla di micro dissezione nel lume per prevenire danni ai tessuti. Tagliare l'esofago mentre si tiene l'estremità e posizionarlo in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri o in una piastra da 24 pozzetti. Immergere l'esofago aperto in 0,5 milligrammi per millilitro di termolisina in HBSS e incubare a 37 gradi Celsius su uno shaker a bilanciere per 15 minuti.

Dopo aver rimosso l'esofago dalla soluzione di termolisina, separare accuratamente l'epitelio esofageo dallo stroma. Trasferire lo strato epiteliale e stromale in due provette separate da microcentrifuga da 1,5 millilitri con 200 microlitri di soluzione di dissociazione in HBSS e metterle su ghiaccio. Tritare l'epitelio esofageo usando un bisturi affilato e raccogliere il tessuto tritato dalla capsula di Petri con 200 microlitri di soluzione di dissociazione.

Trasferirlo in un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 800 microlitri di soluzione di dissociazione fresca e posizionare il tubo con lo strato epiteliale tritato su uno shaker a bilanciere a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Pipettare la soluzione su e giù circa 20 volte utilizzando una punta da 200 microlitri ogni 15 minuti.

Tagliare lo strato stromale in pezzi fini in un tubo da 1,5 millilitri contenente 200 microlitri di soluzione di dissociazione usando forbici da dissezione e aggiungere 800 microlitri di soluzione di dissociazione fresca. Posizionare il tubo su uno shaker a bilanciere a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti di incubazione per la soluzione stromale e 60 minuti di incubazione per la soluzione epiteliale, pipettare la soluzione su e giù per altre 20 volte.

Far passare la soluzione stromale attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri e la soluzione epiteliale attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri in nuove provette da microcentrifuga da 1,5 millimetri. Centrifugare a 300G per 10 minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante rimuovendo il liquido in eccesso con una pipetta da un millilitro. Risospendere il pellet in 200 microlitri di miscela anticorpale.

Dopo aver trasferito la miscela in un tubo di citometria a flusso, incubare le cellule per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere tre millilitri di 1% FBS e centrifugare nuovamente per cinque minuti. Quindi risospendere le cellule in un minimo di 200 microlitri di 1% FBS.

Aggiungere uno a 10.000 marcatori di macchie di cellule morte diluite, cinque minuti prima dello smistamento fax per isolare le cellule vive. Mescolare le cellule epiteliali ordinate e i fibroblasti in un rapporto di uno a due in un tubo. Dopo la centrifugazione a 300 g per cinque minuti, scartare il surnatante rimuovendolo con cura con una pipetta da 200 microlitri.

Lavare le cellule una volta risospendendo il pellet in mezzo organoide basico freddo e centrifugare nuovamente per cinque minuti. Posizionare le cellule sul ghiaccio e scartare il surnatante rimuovendolo con cura con una pipetta da 200 microlitri. Risospendere le celle in 10 microlitri di miscela di matrice per cupola e rimettere il tubo sul ghiaccio.

Prendi la piastra a 48 pozzetti preriscaldata dall'incubatore a 37 gradi Celsius e crea una cupola a matrice per pozzetto. Utilizzando una pipetta da 20 microlitri, aggiungere 200 microlitri di terreno ER basso preriscaldato alle cupole della matrice contenenti co-colture organoidi e mezzo ENR alle rispettive cupole della matrice contenenti solo organoidi epiteliali. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.

E per i primi due giorni, integrare il mezzo con 10 inibitori della roccia micromolare. Rimuovere il mezzo organoide e aggiungere 200 microlitri di PBS ghiacciato alle cupole della matrice. Dopo aver posizionato la piastra sul ghiaccio per cinque o 10 minuti, pipettare su e giù e trasferire la soluzione in un tubo non aderente da 0,6 millilitri.

Centrifugare brevemente per 30-60 secondi a 100 g per far depositare gli organoidi sul fondo. Dopo aver rimosso il liquido in eccesso, aggiungere PBS ghiacciato al tubo e centrifugare nuovamente per 30-60 secondi. Rimuovere il liquido in eccesso come mostrato in precedenza e fissare l'organoide con 200 microlitri di formaldeide fredda al 4% in soluzione PBS per 30 minuti su ghiaccio.

Posizionare il tubo in posizione verticale per far affondare l'organoide e rimuovere la formaldeide. Aggiungere 500 microlitri di PBS freddo per lavare via la formaldeide rimanente. Dopo aver rimosso il PBS in eccesso, aggiungere 500 microlitri di tampone bloccante.

Posizionare il tubo su uno shaker a bilanciere per 60 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone bloccante e risospendere gli organoidi in 200 microlitri di tampone bloccante con anticorpi primari. Posizionare nuovamente gli organoidi su uno shaker a bilanciere durante la notte a quattro gradi Celsius.

Rimuovere la miscela di anticorpi primari e lavare gli organoidi utilizzando 500 microlitri di 0,02% Triton X 100 in PBS per 60 minuti a temperatura ambiente. Ripeti questa operazione tre volte. Allo stesso modo, rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 200 microlitri di anticorpo secondario coniugato a fluorescenza nel tampone di blocco durante la notte a quattro gradi Celsius.

Rilavare gli organoidi utilizzando 0,02% Triton X 100 in PBS seguito da 500 microlitri di PBS. Dopo aver rimosso tutto il liquido in eccesso aggiungere 10 microlitri di soluzione limpida agli organoidi e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Posizionare un distanziatore a quattro pozzetti appiccicoso a doppia faccia da 0,05 millimetri su un vetrino da microscopio.

Aggiungere i 10 microlitri di soluzione di pulizia con gli organoidi in un pozzetto e posizionare un vetrino di copertura sopra il distanziatore. Acquisire immagini utilizzando un sistema di microscopia confocale. Le cellule progenitrici esofagee sono ordinate in base alla loro elevata espressione integrata di beta quattro ed e-caderina.

Il grafico rappresentativo della citometria a flusso dell'isolamento delle cellule epiteliali mostra la percentuale di cellule vive da tutte le singole cellule. La percentuale di cellule progenitrici isolate di integrina beta quattro e e-caderina da tutte le cellule vive è mostrata qui. I grafici di citometria a flusso mostrati qui rappresentano la percentuale di fibroblasti alfa positivi isolati del recettore DPP4+ e Pdgf.

Le immagini in campo luminoso con gli organoidi co-coltivati con fibroblasti positivi al recettore Pdgf alfa H2 BEGFP mostrano il segnale EGFP nucleare. Le immagini a campo luminoso dell'intera cupola della matrice il sesto giorno sono mostrate qui. L'efficienza di formatura degli organoidi è presentata da questa immagine grafica.

Ogni punto rappresenta una cupola a matrice e la barra rappresenta la media di tutti i punti per condizione. Il campo luminoso e le immagini fluorescenti della co-coltura di organoidi del sesto giorno con fibroblasti alfa positivi del recettore Pdgf sono mostrati qui. L'intera immagine di montaggio degli organoidi co-coltivati mostra superfici 3D degli organoidi con fibroblasti positivi alla vimentina avvolti intorno e a stretto contatto con l'organoide.

L'intera colorazione a monte di organoidi mono e co-coltivati con fibroblasti alfa positivi del recettore Pdgf rivela distinte popolazioni cellulari basali e soprabasali. L'efficienza di formazione degli organoidi e la dimensione dell'organoide sono influenzate dal fibroblasto incluso nella co-coltura. Variazioni e risultati sono da aspettarsi quando si utilizzano diverse sottopopolazioni di fibroblasti.

La stessa strategia può essere impiegata per caratterizzare i fibroblasti associati al tumore sia nei topi che negli esseri umani.