O carcinoma epidermóide de esôfago, CEC, é mortal e prevalente em todo o mundo. Organoides tridimensionais podem ser utilizados para acelerar o progresso no campo para combater a carga severa de CEC. Organoides 3D derivados de células únicas de camundongos tratados com 4NQO podem ser manipulados de forma rápida e barata para anotação funcional das alterações moleculares que acompanham o início e o desenvolvimento do CEC.
Este modelo captura a heterogeneidade genética dos tumores induzidos por mutagênios. Portanto, esses organoides fornecem uma plataforma fisiologicamente relevante para testar novas estratégias terapêuticas ou identificar as alterações genéticas salientes que impulsionam a tumorigênese. Quem ajudará a demonstrar a dissecção animal e a coleta de órgãos será Yasuto Tomita, um colaborador da equipe, e demonstrando a preparação do organoide para o procedimento de incorporação de parafina estará Norihiro Matsuura, pesquisador de pós-doutorado do meu laboratório.
Para começar, abra a pele dos camundongos eutanasiados beliscando o pelo abdominal médio e, usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão craniocaudal, ventral da linha média do abdome inferior ao queixo. A partir da incisão na linha média, faça cortes radiais estendendo-se para os membros de ambos os lados do rato, insufle os retalhos cutâneos abertos. Para expor a traqueia cervical, usando tesoura dissecante, divida as glândulas salivares na linha média.
Para expor a traqueia torácica, remova o esterno. Aperte e levante suavemente o peritônio com pinça e use tesoura para dividir o peritônio craniocaudalmente. e lateralmente ao longo da caixa torácica.
Retrair suavemente o fígado da superfície caudal do diafragma e usar tesoura para fazer uma pequena incisão no diafragma na fúrcula esternal, especificamente na superfície dorsal do processo xifoide. Uma vez que a caixa torácica é separada do conteúdo torácico, insira uma tesoura na incisão no diafragma e disseque cranialmente à cintura cervical aderida intimamente à superfície dorsal do esterno para evitar danos aos órgãos abaixo. Corte as costelas de cada lado do esterno usando uma tesoura e retire o esterno.
Para expor o esôfago abdominal, levante suavemente o estômago anteriormente segurando o antro com pinças. Usando tesoura, disseque o baço, pâncreas e mesentério do estômago e esôfago. Para expor o esôfago torácico, levante suavemente a traqueia imediatamente caudal à cartilagem tireoide e disseque o esôfago da face dorsal da traqueia usando tesoura de íris.
Divida a traqueia na cartilagem tireoide com uma tesoura de íris. Descasque a traqueia do restante do esôfago, dissecando-a cuidadosamente no sentido caudal. Remova o pulmão, o coração e o timo completamente com a traqueia.
Divida o estômago no piloro com uma tesoura. Separe o esôfago da vértebra segurando o antro com pinça e dissecando cranialmente. Divida o esôfago ao nível da cartilagem tireoide e retire o esôfago e o estômago completamente.
Separe o estômago e o esôfago dividindo o esôfago na cárdia e disseque qualquer fáscia na superfície externa do esôfago. Para reservar uma amostra para histologia, dividir longitudinalmente com uma tesoura. Coloque o esôfago intacto restante e PBS frio no gelo.
Abra o estômago ao longo da curvatura maior e lave com PBS suficientemente. Separe o estômago anterior e lave com PBS frio. Para colher a língua, retire a agulha presa do nariz e puxe a língua com uma pinça.
Corte a língua o maior tempo possível e coloque-a em PBS fria no gelo. Após a transferência do tecido dissociado para uma placa de cultura, remova cuidadosamente a camada muscular do epitélio usando pinças. Transferir o epitélio para um tubo de microcentrífuga contendo 500 microlitros de tripsina a 0,25% e incubar em um termomisturador por 10 minutos a 37 graus Celsius e 800 rpm.
Após uma breve centrifugação, transfira a suspensão celular através de um filtro de células de 100 micrômetros mantido em um tubo cônico de 50 mililitros com uma ponta de furo largo usando movimentos circulares, em seguida, adicione 3 mililitros de inibidor de tripsina de soja, ou IST, através do filtro usando movimentos circulares para lavar, em seguida, esfregue o filtro com a base de um êmbolo de seringa tuberculínica de 1 mililitro para empurrar as células. Lave o filtro com 3 mililitros de PBS 3 a 5 vezes, esfregando o filtro com a base da seringa entre as lavagens. Após a peletização das células por centrifugação, remova o sobrenadante deixando 1 mililitro de solução no tubo para ressuspensão.
Uma vez que o pellet é ressuspenso, transfira a suspensão da célula através de um filtro de células de 70 micrômetros para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Depois de centrifugar o tubo novamente, ressuspenda o pellet em 100 microlitros de meio organoide de camundongo, ou MOM, e realize uma contagem de células automatizada. Placa 5.000 células viáveis em extrato de membrana basal a 75%, ou BME, e MOM com volume total de 50 microlitros por poço.
Usando uma ponta larga de 200 microlitros, adicione lentamente uma gota de 50 microlitros ao centro de cada poço, evitando o contato entre a ponta e o fundo ou as laterais do poço. Deixe o BME solidificar por 30 minutos em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade relativa. Após a incubação, adicione cuidadosamente 500 microlitros de MOM por poço.
Troque a MOM no dia 3 ou 4, e depois a cada 2 a 3 dias até estar pronta para a passagem. Mantenha a EMB descongelada no gelo, pré-aqueça MOM, 0,05% de tripsina e IST a 37 graus Celsius antes de usar. Usando uma ponta de micropipeta de furo largo, colete os organoides na cúpula da BME junto com o sobrenadante e interrompa a BME pipetando para cima e para baixo.
Após a obtenção do organoide pellet por breve centrifugação, uma vez deslocado, ressuspendê-lo em 500 microlitros de tripsina a 0,05%. Incubar o tubo num termomisturador a 37 graus Celsius e 800 rpm durante 10 minutos. Inativar a tripsina com 600 microlitros de IST.
Após centrifugar e descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em 100 microlitros de MOM. Execute uma contagem de células automatizada por exclusão azul de tripano. Para fixar os organoides, desloque suavemente o pellet e ressuspenda em 300 microlitros de paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 graus Celsius.
Em seguida, prepare uma superfície de incorporação invertendo um rack de tubo de microcentrífuga e cobrindo a superfície com uma folha de filme de teto e, em seguida, rotule com o ID organoide correspondente. Sobreponha cuidadosamente o paraformaldeído removido em pellet organoide lavado com PBS adicionando 50 microlitros de ágar na lateral do tubo. Repita esta etapa.
Sem perturbar o pellet, transfira o pellet na gota de gel de ágar para a película de teto na superfície de incorporação para solidificação a 4 graus Celsius por 45 minutos. Usando pinças, transfira cuidadosamente a gota contendo a pastilha organoide solidificada para um de patologia marcado. Os organoides murinos esofágicos, língua e pré-estômago murinos normais foram analisados morfologicamente por imagem de campo claro e coloração histológica.
O carcinoma epidermóide esofágico de camundongo tratado com 4NQO apresentou atipia nuclear e queratinização abrupta. A capacidade de auto-renovação dos organoides, avaliada pela determinação da taxa de formação de organoides no subcultivo, mostrou que a taxa de formação diminui em função do tempo, refletindo a diminuição das células basaloides proliferativas nos organoides maturados. A cinética de crescimento dos organoides é revelada por sua morfologia em vários momentos.
A queratinização do núcleo interno dos organoides torna-se proeminente no dia 10. As células basaloides proliferativas permanecem na camada celular mais externa, mesmo nos momentos 14 e 21 dias. Uma curva de duplicação populacional de organoides normais da língua de camundongos gerados a partir de camundongos não tratados com 4NQO demonstra seu crescimento constante ao longo de múltiplas passagens e cultura de longo prazo.
Os organoides são plataformas para triagem de alto rendimento para identificar novos alvos terapêuticos, edição baseada em CRISPR para interrogar a função específica do gene ou co-cultura para definir quais interações no microambiente tumoral influenciam a transformação. Esta técnica tem permitido investigar fenômenos como EMT parcial e infecção pelo HPV, juntamente com sua interação com o sistema imune na biologia de cânceres espinocelulares do trato aerodigestivo.
