Através da medição das propriedades eletrofisiológicas das membranas celulares, a questão das principais provas de que modular a atividade elétrica de uma célula pode ser resolvida. O registro de patch clamp de células inteiras é uma técnica periférica para estudar correntes iônicas em células individuais e interrogar a resposta celular a diferentes estímulos. O melhor desempenho em pré-gravações de grampos de patch de célula inteira será alcançado depois de praticar e estudar muito.
Para iniciar a dissecção cerebral, faça uma incisão usando tesoura cirúrgica na pele na parte superior do crânio do animal decapitado do caudle ao rostral e remova o couro cabeludo. Em seguida, cortar a placa interparietal ao longo da sutura sagital com a tesoura da íris e remover o osso occipital. Deslize o osteótomo sob o osso parietal e retire-o suavemente até que o cérebro fique exposto.
Depois de expor o cérebro, vire a cabeça de cabeça para baixo. Abaixe suavemente o cérebro para visualizar o nervo trigêmeo de cada lado. Em seguida, corte o nervo trigêmeo com tesoura curva Castroviejo.
Depois de visualizar o hipotálamo identificar o nervo óptico e cortá-lo suavemente. Em seguida, corte a porção anterior do lobo frontal. Retire o cérebro e mergulhe-o imediatamente na solução de fatiamento até adquirir as fatias.
Para fatiar as amostras cerebrais, coloque o cérebro em um papel de filtro para secar o excesso de solução. Em seguida, com uma lâmina de barbear de corte afiado realizar um corte coronal separando o tronco cerebral com o cerebelo do resto do tecido. Em seguida, cole a porção do cérebro na base de um vibratótomo e preencha a câmara do dispositivo de fatiamento com a solução de fatiamento ou solução de aCSF resfriada a zero a dois graus Celsius.
Embale gelo seco ao redor da câmara vibratória para manter a solução fatiada fria durante o procedimento. Insira a lâmina de barbear no vibratomo e defina os parâmetros de corte do dispositivo, como velocidade para três, frequência para nove e alimentação para 250 micrômetros. Durante o procedimento de fatiamento do tecido, transferir os cortes com pipeta de acrílico para a câmara de recuperação e aguardar 60 minutos para recuperação do tecido após a aquisição do corte.
Antes de iniciar a selagem e gravação das células, ligue o microscópio, amplificador, digitalizador e micromanipulador. Construa a câmara de gravação conectada ao microscópio com a solução de aCSF. Use uma bomba de perfusão para perfundir constantemente o aCSF a dois mililitros por minuto.
Verifique as configurações do software e crie protocolos específicos para as gravações de acordo com o tipo de experimento. Transfira uma fatia cerebral de interesse, uma de cada vez, para a câmara de gravação usando uma pipeta de transferência de acrílico. Segure o corte com uma âncora de corte para que ele não se mova durante a perfusão do aCSF.
Posicione o corte no centro da câmara de gravação usando a lente objetiva de baixa potência do microscópio de imersão, 10X ou 20X. A posição do corte é fundamental para permitir uma boa visualização da região desejada sob o microscópio e para um alcance perfeito para a micropipeta de registro. Após localizar a região de interesse, mude a lente objetiva para a lente de alta potência, 63X e foque no nível do tecido observando a proteína fluorescente endógena e as formas das células na região alvo para localizar as células kisspeptina na superfície do corte cerebral.
Quando uma possível célula de destino estiver localizada, marque-a na tela do computador com o cursor do mouse ou desenhando um formato como um quadrado sobre a área de interesse. A marca de tela do computador ajuda a orientar a posição da pipeta de gravação para a célula. Depois de determinar a localização exata da célula alvo, levante a objetiva e introduza a micropipeta de gravação preenchida com a solução interna no suporte do eletrodo, garantindo que a solução interna esteja em contato com o eletrodo de prata.
Aplique uma pressão positiva antes de submergir a micropipeta na solução de aCSF usando uma seringa de um a três mililitros cheia de ar conectada ao suporte da micropipeta através de uma tubulação de polietileno para evitar que detritos entrem na micropipeta. Usando o micromanipulador guie a micropipeta abaixo do centro da objetiva. Mova os botões do micromanipulador para guiar o eixo XYZ da micropipeta em direção à célula de interesse.
Ajuste o foco para ver a ponta da micropipeta e aproxime o foco, mas não muito perto da fatia. Reduza a velocidade do micromanipulador e abaixe lentamente a micropipeta para o plano de foco, garantindo que a ponta da micropipeta não penetre abruptamente na fatia, mas desça lentamente até tocar a superfície da célula ou a região alvo. Aplicar pressão positiva leve com uma seringa cheia de ar de um a três mililitros para limpar quaisquer detritos do caminho de aproximação.
Mova lentamente o micromanipulador no eixo XYZ para aproximar a ponta da micropipeta e tocar a célula alvo, o que causa uma covinha pela pressão aplicada. Após o estabelecimento da covinha com a ajuda do modo de fixação de tensão no software, aplique uma sucção fraca breve por via oral por um a dois segundos através do tubo conectado ao suporte da micropipeta para gerar a vedação entre a micropipeta até a célula. Se a vedação permanecer mecanicamente estável sem interferência de ruído por cerca de um minuto, ajuste a tensão de retenção no potencial de repouso fisiológico mais próximo da célula de interesse.
Para kisspeptina neurônios hipotalâmicos menos 50 milivolts é recomendado. Em seguida, aplique uma breve sucção por via oral para quebrar a membrana plasmática na ponta da micropipeta selada colocada na célula para que a membrana rompida não obstrua a micropipeta ou atraia uma porção considerável da membrana ou da célula. Uma configuração adequada de célula inteira pode ser alcançada realizando sucção com força suficiente.
Verifique o manual de configurações do sistema usado. Depois de quebrar a membrana celular ativar a opção de célula inteira no modo de fixação de tensão e clique no comando automático referente a toda a guia da célula. A resistência em série da célula e a capacitância de toda a célula são calculadas automaticamente e exibidas instantaneamente pelo software.
Em seguida, verifique os parâmetros de viabilidade celular no software, conforme descrito no manuscrito do texto. Monitorar a resistência em série e a capacitância em estado estacionário da célula durante os experimentos. Uma vez que toda a configuração da célula é adequadamente alcançada meça as correntes sinápticas no modo de fixação de tensão.
Registrar as alterações no potencial de membrana de repouso e as variações induzidas do potencial de membrana de repouso no modo de pinça atual. Os possíveis efeitos do hormônio de crescimento humano recombinante sobre a atividade dos neurônios hipotalâmicos da kisspeptina foram estudados com a ajuda de registros de patch clamp de células inteiras. A administração de hormônio de crescimento humano recombinante, HGH em 20 microgramas por grama induziu uma hiperpolarização significativa do potencial de membrana de repouso em 5 de 12 neurônios de kisspeptina AVPV/PeN e 9 de 14 neurônios de kisspeptina ARH registrados.
Os neurônios hiperpolarizados AVPV/PeN kisspeptin e ARH kisspeptin alteraram significativamente o potencial de membrana de repouso em comparação com as células não responsivas. Os efeitos sobre o potencial de membrana de repouso durante a aplicação de HGH seguiram uma redução significativa da resistência de entrada de células inteiras de aproximadamente 0,9 a 0,7 gigaohms nos neurônios de kisspeptina AVPV/PeN e 1,7 a 1,0 gigaohms nos neurônios de kisspeptina ARH. Durante as linhas cerebrais perfeitas realizadas através de gigaseal cuidadoso e a coisa da área na célula através de parâmetros de praia são necessários para alcançar os melhores registros de célula inteira.
A solução de micropipeta da célula gravada pode ser coletada e utilizada para RTPCR de célula única, permitindo a caracterização molecular de uma célula isolada. A técnica de patch clamp de células inteiras combinada com o uso de animais geneticamente modificados representa um avanço no entendimento da reprodução permitindo a definição de propriedades aumentadas dos neurônios kisspeptin, sendo eles os principais moduladores.
