Este protocolo detecta com precisão os recursos de dobramento cromossômico em várias escalas de comprimento com um sinal de fundo baixo. Por exemplo, as interações do potenciador do promotor podem ser analisadas no contexto dos compartimentos cromossômicos. O uso de endonucleases de restrição contorna a otimização do nível de digestão do material de entrada.
Nenhuma seleção por isolamento de gel é necessária para capturar produtos de ligadura. O problema mais comum é a perda de células após a fixação do DSG e a captura de DNA suficiente para produzir bibliotecas de alta qualidade. Para começar, aspirar o meio com uma pipeta Pasteur acoplada a um purgador de vácuo da placa de 150 milímetros contendo 5 por 10 até as sextas células.
Lave as células duas vezes com 10 mililitros de HBSS. Para reticular as células, despeje 23,125 mililitros da solução de 1% de formaldeído na placa de 15 centímetros. Incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos, agitando suavemente a placa à mão a cada dois minutos.
Em seguida, adicione 1,25 mililitros de glicina 2,5 molar e gire suavemente a placa para extinguir a reação de reticulação, antes de incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Continue a incubação no gelo por 15 minutos para parar a reticulação. Raspe as células da placa com um raspador de células ou um policial de borracha e transfira a suspensão da célula para um tubo cônico de 50 mililitros com uma pipeta.
Centrifugar a suspensão a 1 000 vezes G durante 10 minutos à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante por aspiração. Lave o pellet uma vez com 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, ou DPBS. Em seguida, centrifugar novamente antes de prosseguir para a reticulação DSG.
Para reticulação com DSG, ressuspenda as células peletizadas em 9,9 mililitros de DPBS. Em seguida, adicione 100 microlitros de DSG de 300 milimolares. Misture o tubo por inversão e faça a ligação cruzada das células à temperatura ambiente durante 40 minutos num rotador.
Após a reticulação, adicione 1,925 mililitros de glicina 2,5 molares, inverta para misturar e incube à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, centrifugar as células a 2.000 vezes G por 15 minutos e ressuspender o pellet em um mililitro de 0,05% de albumina sérica bovina DPBS antes de transferi-lo para um tubo de 1,7 mililitro. Centrifugar as células a 2.000 vezes G durante 15 minutos a quatro graus Celsius e eliminar o sobrenadante.
Congele o pellet em nitrogênio líquido antes de prosseguir para a captura de confirmação cromossômica. Ressuspeite a alíquota de células reticuladas em um mililitro de tampão de lise gelada contendo 10 microlitros de coquetel inibidor de protease e transfira para um homogeneizador Dounce por 15 minutos de incubação no gelo. Mova lentamente o pilão A para cima e para baixo 30 vezes para homogeneizar as células e incubar por um minuto para permitir que as células esfriem antes de mais 30 golpes.
Após o último traço, transfira o lisado para um tubo de 1,7 mililitro. Centrifugar a suspensão lisada a 2, 500 vezes G durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante e agite ou vórtice para ressuspender o pellet molhado.
Remova o máximo possível do sobrenadante para obter uma substância semelhante a iogurte com o mínimo de aglomerados. Ressuscite o pellet em 500 microlitros de tampão de restrição gelada antes da centrifugação. Após a segunda lavagem, ressuscite o pellet em 360 microlitros de tampão de restrição por pipetagem depois de adicionar aproximadamente 340 microlitros ao volume de carryover do pellet, dependendo do tamanho da célula.
Reserve 18 microlitros de lisado para testar a integridade da cromatina, ou CI.To lisado restante, adicione 38 microlitros de dodecil sulfato de sódio a 1% ao tubo hi-C para fazer um volume total de 380 microlitros e misture cuidadosamente pipetando sem introduzir bolhas. Incubar as amostras a 65 graus Celsius sem agitar durante 10 minutos para abrir a cromatina. Em seguida, coloque imediatamente o tubo no gelo.
Depois de preparar a mistura de digestão com Triton X-100, adicione 107 microlitros desta mistura ao tubo hi-C para fazer um volume total de 487 microlitros e digerir a cromatina durante a noite a 37 graus Celsius em um termócamo com agitação intervalar. No dia seguinte, transfira as amostras para 65 graus Celsius por 20 minutos para desativar a atividade restante da endonuclease. Depois de colocar a amostra no gelo, reserve 10 microlitros de controle de digestão, ou DC, e armazene-os a quatro graus Celsius.
Remova a condensação da tampa com uma pipeta ou girando. Em seguida, adicione 58 microlitros de mistura de preenchimento de biotina para fazer um volume total de 535 microlitros. Pipetar suavemente sem formar bolhas antes de incubar a 23 graus Celsius durante quatro horas numa termímetro.
Após a incubação, adicionar 665 microlitros de mistura de ligadura, tornando o volume da amostra 1, 200 microlitros. Misture a amostra por pipetagem e incube a 16 graus Celsius durante quatro horas numa termificante. Em seguida, adicione 50 microlitros de proteinase-K em duas frações ao tubo de amostra hi-C e incube durante a noite a 65 graus Celsius com agitação intervalar.
Para a purificação do DNA, adicione etanol 100% gelado e centrifugar os tubos a 18.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Retirar completamente o sobrenadante do lado não pellet e secar a amostra ao ar durante 10 minutos ou até que os pellets estejam visivelmente secos. Uma vez que os pellets estejam secos, solubilize-os em 450 microlitros de Tris low-EDTA por pipetagem ou rodopiando.
Transfira a suspensão solubilizada para a unidade de filtro centrífugo de 0,5 milímetros, ou UFC, com um ponto de corte de peso molecular de três quilodaltons. Centrifugar a UFC à velocidade máxima durante 10 minutos e eliminar o fluxo. Após a segunda lavagem, adicione 80 microlitros de Tris low-EDTA à coluna.
Transformar a coluna num novo tubo de recolha durante dois minutos de centrifugação à velocidade máxima. Finalmente, carregue as amostras em um gel de agarose a 0,8%. O gel de agarose com resultados de titulação por PCR demonstrou que a maioria das bibliotecas requer cinco a oito ciclos de amplificação final por PCR.
A digestão celular da biblioteca final de PCR amplificada, como observado por fragmentos menores em um gel de agarose, confirma a presença de junções de ligadura adequadas e serve como uma verificação de qualidade antes do sequenciamento. Após o sequenciamento, os dados mapeados mostraram que a combinação de DpnII e DdeI aumenta significativamente os contatos de curto alcance, como a adição de DSG à reticulação convencional de formaldeído. Um sinal melhorado também pode ser observado a longas e curtas distâncias diretamente das matrizes de interação 2D.
Os sinais compartimentais são CRISPR a longas distâncias e os pontos formados por laços de cromatina são mais proeminentes a curtas distâncias. Além do formaldeído, a reticulação com DSG diminui as ligaduras aleatórias, melhorando a cobertura relativa em cis. É importante não perder células durante e após a reticulação.
Os pellets de células podem estar soltos ou invisíveis, e as células podem grudar nas pontas da pipeta em alguns dos buffers.
