A captura Hi-C permite decifrar a organização da cromatina 3D da região genômica de interesse do tamanho da megabase em alta resolução. Com o Capture Hi-C, maior resolução e especificidade alélica são alcançadas, melhorando a eficácia do tempo e a acessibilidade da técnica. A aplicação do Capture IC a diferentes sistemas modelo, tipos celulares e paisagens de cromatina reguladas pelo desenvolvimento em condições de saúde e patologias provavelmente facilitará nossa compreensão da interação entre a topologia do genoma e a regulação gênica.
Para começar, triptonize e conte células da placa de controle preparada especificamente para contagem de células usando um contador de células automatizado. Incluir coloração de viabilidade para determinar a porcentagem de células viáveis. A partir dessa contagem de células, estimar o número total de células na placa preparada para reticulação.
Retire o meio de cultura das placas preparadas para reticulação e substitua-o pela solução de fixação. Fixe durante 10 minutos à temperatura ambiente sob mistura suave numa agitadora. Atenuar a reação fixa adicionando glicina 2,5 molar PBS a uma concentração final de 0,125 molares.
Adicione 530 microlitros de glicina 2,5 molar PBS a 10 mililitros em uma placa de 10 centímetros. Incubar durante cinco minutos à temperatura ambiente, misturando suavemente num agitador. Transfira as placas para o gelo e incube por mais 15 minutos no gelo, misturando suavemente em uma coqueteleira.
Retire a solução de fixação das células, despejando-a em um copo para garantir um manuseio rápido. Lave a placa de 10 centímetros rapidamente duas vezes com cinco mililitros de glicina 0,125 molar fria PBS para lavar os detritos e as células mortas. Retire o líquido da placa despejando-o em um copo para garantir um manuseio rápido.
Adicione cinco mililitros de glicina fria 0,125 molar PBS à placa de 10 centímetros. E raspe rapidamente as células da placa usando um raspador de células de plástico. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros pré-resfriado usando uma pipeta sorológica.
Enxaguar a placa duas vezes com cinco mililitros de glicina PBS 0,125 molar fria e adicionar a suspensão celular ao tubo de centrífuga cônica. Gire para baixo a 480 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante aspirando com um sistema de aspiração de bancada.
Ressuspenda as células e aliquote 500 microlitros da suspensão celular no número calculado de tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Gire para baixo a 480 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius e armazene os pellets de células secas a 80 graus Celsius. Para lise celular, descongele os pellets congelados no gelo.
Prepare 1,5 mililitros de tampão de lise em água. Adicione 600 microlitros do tampão de lise a frio e ressuspenda bem no gelo. Gire para baixo a 2.655 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e remova o sobrenadante usando um sistema de aspiração de bancada.
Ressuspenda em 100 microlitros de SDS 0,5%. Após a incubação a 62 graus Celsius rodopiando a 1400 RPM por 10 minutos, adicione 290 microlitros de água mais 50 microlitros de 10% Triton X 100 e misture bem, evitando bolhas de ar. Incubar a 37 graus Celsius com rodopio a 1400 RPM por 10 minutos antes de adicionar 50 microlitros de tampão de tubo de 10 X DPN e inverter o tubo para misturar.
Tome 50 microlitros de DNA não digerido para controle de qualidade em um tubo separado. Não se esqueça de tomar a amostra de controle não digerida. Para digestão com DPN2, adicione 10 microlitros de DPN2 de alta concentração e misture invertendo.
Incubar as amostras e o controle não digerido em um misturador térmico a 37 graus Celsius, rodopiando a 1400 rotações por minuto por mais de quatro horas. Para ligadura e reversão da reticulação, tomar 50 microlitros do DNA digerido ligado para controle de qualidade em um tubo separado. Armazene os controles não digeridos e não ligados a 20 graus Celsius.
Adicione 800 microlitros de coquetel de ligadura. Incubar a 16 graus Celsius, rodopiando a 1000 rotações por minuto durante a noite. Para a purificação do DNA, transfira as amostras no gelo para pré-resfriar tubos de centrífuga cônica de 15 mililitros e adicione dois mililitros de água, 10,5 mililitros de etanol gelado e 583 microlitros de acetato de sódio três molar.
Adicionar 200 microlitros de etanol gelado, 10,8 microlitros de acetato de sódio e um microlitro do coprecipitante aos controles de qualidade não digeridos e ligados. Incubar a 80 graus Celsius negativos por pelo menos quatro horas até a noite. Gire os tubos de 15 mililitros a 2200 G a quatro graus Celsius por 45 minutos.
Retire cuidadosamente o etanol e seque ao ar as amostras e controles à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Não seque demais. Ressuspender as amostras e controles em 100 microlitros e 20 microlitros de água, respectivamente.
Para controle de qualidade da preparação do molde 3C, carregar de 100 a 200 nanogramas de cada amostra e cada controle em um gel 1XTBE 1%agros. Em seguida, para realizar o enriquecimento do alvo para sequenciamento multiplex final pared, pegue quatro microgramas do modelo 3C, ressuspenda-o em 130 microlitros de água para cada reação de captura. Sonicar a amostra e continuar a preparação com três microgramas do DNA cisalhado.
Para hibridizar as amostras preparadas para DNA para as sondas de RNA alvo-específicas, use 750 nanogramas de amostras de DNA em um volume final de 3,4 microlitros, resultando em uma concentração inicial de 221 nanogramas por microlitro. Use a concentração de vácuo de velocidade se necessário para atingir o volume final de 3,4 microlitros. Para amostras ressuspensas em 10 microlitros, 15 a 20 minutos de concentração são suficientes.
Incubar a mistura de hibridização por 16 a 18 horas a 65 graus Celsius com uma tampa aquecida a 105 graus Celsius, de acordo com as instruções do fabricante. Para capturar os fragmentos de ligadura visados, adicionar estreptivida em esferas acopladas à amostra hibridizada da sonda. Finalmente, para preparar as amostras para o sequenciamento multiplex, continuar o protocolo de acordo com o sistema de enriquecimento de alvo utilizado neste estudo para o sequenciamento pareado e multiplexado.
A resolução do mapa de interação Capture Hi-C permite a identificação de dois domínios menores no Tsix-tad que contém o promotor do locus Tsix. Isso não foi alcançado anteriormente com 5C. Além disso, outras estruturas sub-tad, como loops de contato, são claramente visíveis a partir dos dados do Capture Hi-C, como o loop entre Xist e FTX, previamente identificado com Capture C e o loop entre Xist e Xert recentemente identificado usando um protocolo semelhante para Capture Hi-C.
Outros contatos também podem ser mapeados com mais precisão devido ao aumento da resolução dos perfis Capture Hi-C, como aqueles que formam os hotspots de contato conhecidos dentro do Tsix-tad entre os loci Linx, Chic1 e Xite. Em comparação com os dados Hi-C mostrados, o Capture Hi-C permitiu um aumento de quatro vezes na resolução, mas exigiu apenas um quarto da profundidade de sequenciamento. É muito importante não esquecer de tomar 50 microlitros de amostras de DNA não digeridas e não ligadas como controle de qualidade para a preparação do molde 3C.
