Os autores agradecem ao Centro de Patologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Surrey pelos serviços de histologia. Também agradecemos aos Drs. L. Dixon, A. Reis e M. Henstock do The Pirbright Institute (Pirbright, Reino Unido) por seu apoio na aquisição dos tecidos animais, e ao Departamento de Ciências Bioquímicas da Universidade de Surrey, especialmente à equipe técnica, por seu apoio contínuo. O RSM foi apoiado pelo prêmio de estudante do Doctoral College (University of Surrey), DM e PC foram apoiados pelo National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (números de bolsa: NC/R001006/1 e NC/T001216/1).

Este protocolo descreve a montagem e utilização de um sistema composto por duas pastilhas EasyFlow (biorreator): uma representando a câmara de reação (C), contendo a amostra da artéria perfundida, e outra funcionando como reservatório médio (R) (Figura 1 e Figura 2A). As artérias carótidas foram obtidas de leitões machos e fêmeas (6-12 kg) com 4-6 semanas de idade no The Pirbright Institute, Reino Unido. Os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986) (ASPA) e aprovados pelo Animal Welfare and Ethical Review Board (AWERB) do The Pirbright Institute. Os animais foram alojados de acordo com o Código de Práticas para o Alojamento e Cuidados com os Animais Criados. Todos os procedimentos foram conduzidos por titulares de Licença Pessoal treinados e competentes sob a Licença de Projeto PPL70/8852. Os leitões foram abatidos de acordo com o método do esquema um, sob o ASPA.
1. Fabricação de pastilhas
<ol><li>Fabricar a pastilha por impressão 3D, utilizando o modelo 3D fornecido (Arquivo Suplementar 1). NOTA: A modelagem 3D permite alterações fáceis no projeto para se adaptar a novas aplicações. Materiais alternativos e técnicas alternativas de fabricação também podem ser usados para produzir a pastilha. Devido à complexa estrutura interna, a sinterização seletiva a laser e a estereolitografia são alternativasapropriadas 15. A poliamida 12 (PA12; ver Tabela de Materiais) é um bom material candidato devido ao seu desempenho superior em termos de retenção de líquidos e resistência a ciclos repetidos de esterilização por calor16.</li>
	<li>Fabricar as juntas de silicone e as arruelas de policarbonato por corte a laser17, utilizando os desenhos fornecidos no Arquivo Suplementar 2. NOTA: O corte a laser é facilmente terceirizado e um método de fabricação barato. As arruelas podem ser fabricadas em aço inoxidável, proporcionando um componente mais resistente para uso repetido. Todos os outros componentes são itens disponíveis comercialmente. Uma lista completa dos materiais necessários é fornecida na Tabela 1. Os detalhes comerciais dos itens estão incluídos na Tabela de Materiais.</li>
</ol>2. Esterilização, montagem e escorvamento de dispositivos
<ol><li>Esterilizar todos os componentes seguindo as instruções da Tabela 1.</li>
	<li>Em condições de fluxo laminar, montar dois insertos fabricados (etapa 1), como mostra a Figura 1A.</li>
	<li>Monte o sistema de perfusão conforme a Figura 2, seguindo os passos abaixo:<ol><li>Conecte duas válvulas de três vias conectadas à porta R1 do reservatório (porta de troca de mídia).</li>
		<li>Conecte a saída resultante à cabeça da bomba peristáltica usando um tubo equipado com uma válvula unidirecional (tubo de válvula unidirecional).</li>
		<li>Conecte o cabeçote da bomba à porta C4 da câmara de reação usando a tubulação do sistema equipada com uma válvula unidirecional. NOTA: Este ramo pode opcionalmente ser equipado com um sensor de pressão que permite a monitorização constante.</li>
		<li>Conecte a porta C1 da câmara de reação à tubulação de parede macia, e esta ao canal de resistência (pequeno diâmetro interno). NOTA: O comprimento da tubulação de resistência influenciará muito a pressão presente no sistema. Isso deve ser mais bem investigado para garantir condições adequadas de perfusão.</li>
		<li>Estender o canal de resistência com a tubulação do sistema, criando um canal de retorno e fechando o circuito de circulação luminal conectando-se ao reservatório em R5 (Figura 2C).</li>
		<li>Crie um canal de transbordamento conectando a câmara de reação C3 ao reservatório R3 com a tubulação do sistema.</li>
		<li>Conecte um filtro de ventilação através de R2.</li>
		<li>Crie um amortecedor de pressão conectando uma seringa contendo ar e meio à câmara de reação C6. NOTA: A relação ar-mídia correta dependerá do amortecimento de pressão necessário.</li>
	</ol></li>
	<li>Primer o sistema com meio de perfusão (meio águia modificado de Dulbecco [DMEM] + 10% [v/v] soro fetal bovino [SFB] + 1% [v/v] penicilina-estreptomicina + 1% [v/v] anfotericina B + 30% [v/v] dextrano; ver Tabela de Materiais) através das portas de troca de meios e do reservatório. NOTA: O escorvamento do sistema reduz o risco de bolhas presas no sistema e identifica possíveis vazamentos. O volume recomendado de mídia é de cerca de 100-120 mL. O volume utilizado dependerá do volume morto da tubulação utilizada para experimentação.</li>
</ol>3. Colheita e preparação das amostras
<ol><li>Coletar as artérias carótidas comuns direita e esquerda, minimizando o manuseio direto do tecidoarterial13.</li>
	<li>Colocar o tecido em meios de transporte a frio (DMEM + 20% [v/v] FBS + 2% [v/v] penicilina-estreptomicina + 1% [v/v] anfotericina B, ver Tabela de Materiais) para transferência.</li>
	<li>Em um gabinete de fluxo laminar, remova o excesso de tecido conjuntivo e corte as extremidades do tecido usando uma lâmina de bisturi. Lave o tecido duas vezes em meio de transporte frio.</li>
	<li>Coloque o tecido em um agitador orbital em meio de transporte por pelo menos 30 min para uma lavagem completa.</li>
	<li>Conectar um segmento não ramificado da artéria ao sistema do biorreator usando dois conectores luer farpados e fixá-lo no lugar usando uma ligação vascular (laços vasculares de silicone; Tabela 1). OBS: A ligação do vaso proporciona a tensão e a retração adequadas para fixar o vaso. A secção oval previne danos teciduais.</li>
	<li>Fluir suavemente através da artéria para verificar a patência.</li>
	<li>Após fixar a artéria ao inserto fabricado, preencher o espaço de reação com meios de perfusão (passo 2.4). Finalmente, preencha suavemente o circuito de circulação luminal com mídia para eliminar qualquer ar restante do sistema.</li>
	<li>Conectar o espaço de reação com o sistema de perfusão previamente montado (seção 2), completando a circulação. NOTA: Recomenda-se realizar uma verificação de qualidade por imunohistoquímica do tecido processado. Isso identifica qualquer dano devido ao manuseio excessivo durante a preparação.</li>
</ol>4. Cultura de perfusão e mudança de mídia
<ol><li>Colocar o sistema de perfusão numa incubadora a 37 °C com CO2 a 5% e, em seguida, ligá-lo a uma bomba peristáltica (ver Tabela de Materiais)</li>
	<li>Conecte quaisquer sistemas de aquisição adicionais (facultativos), como sensores de pressão (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Deixe o sistema se equilibrar durante a noite com uma baixa taxa de fluxo de meio de ~10-15 mL/min. NOTA: Experimentos iniciais para determinar as configurações da bomba, o fluxo do meio, a pressão do sistema e as configurações ideais de amortecedores/grampos de pressão são necessários para garantir que as condições apropriadas sejam atendidas.</li>
	<li>No dia seguinte, aumente o fluxo incrementalmente (+1 rpm a cada hora, equivalente a um aumento de ~2,5 mL/min a cada hora, no sistema atual) até que o fluxo final (35 mL/min) seja alcançado. Monitore o sistema periodicamente em busca de vazamentos. NOTA: Para calcular o caudal exacto com base na velocidade peristáltica da bomba, os utilizadores devem primeiro efectuar uma calibração adequada da bomba18. Usando a fórmula (1), o fluxo volumétrico (Q) pode ser calculado com base no volume dispensado (V) dentro de um determinado tempo (t). Para calcular a velocidade de fluxo estimada () podemos utilizar a vazão (Q) previamente calculada e a área de secção transversa do vaso (A), descritas na equação (<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/65465/65465eq03.jpg" style="margin: auto;">2). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65465/65465eq01.jpg" style="margin: auto;">(1º) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65465/65465eq02.jpg" style="margin: auto;">(2º)</li>
	<li>A cada 3 dias, trocar 50% do meio (~50 mL) conectando uma seringa preenchida com meio fresco à porta de troca do meio mais próxima da bomba e uma seringa vazia ao orifício mais próximo do reservatório para coletar o meio gasto (Figura 2). OBS: A utilização de duas válvulas de três vias como portas de troca de meios facilita a operação contínua da perfusão durante a troca do meio.</li>
	<li>Ao final do experimento, retirar o tecido da câmara de reação aparando as extremidades conectadas ao biorreator com tesoura cirúrgica estéril.</li>
	<li>Desmonte, limpe e esterilize o sistema para uso posterior.</li>
</ol>5. Análise da amostra
<ol><li>Fixar a amostra colhida em paraformaldeído (PFA) a 4% durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Incorporar o tecido em temperatura ótima de corte (OCT; ver Tabela de Materiais)19 e congelar por imersão em iso-pentano resfriado em nitrogênio líquido.</li>
	<li>Obter criosecções de 3-5 mm de espessura usando um criostato.</li>
	<li>Realizar imunohistoquímica (hematoxilina e eosina [H&E]) e/ou imunofluorescência. Siga o protocolo típico de imunofluorescência:<ol><li>Bloquear as fatias durante 1 h à temperatura ambiente com soro de cabra a 20% [v/v] em solução salina tamponada com fosfato (PBS; ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Incubar as fatias durante a noite a 4 °C com anticorpo primário de coelho contra CD31 diluído 1:50 em PBS (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Lave três vezes com PBS por 5 min.</li>
		<li>Incubar durante 1 h a 37 °C com anticorpo secundário de cabra anticoelho fluorescentemente marcado diluído 1:200 em PBS e anticorpo fluorescente diretamente conjugado de actina de músculo liso α (SMA) diluído 1:200 em PBS (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Lave três vezes com PBS por 5 min.</li>
		<li>Corar os núcleos com DAPI diluído 1:1.000 em PBS por 10 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar com 0,1% (p/v) de Sudan Black (ver Tabela de Materiais) em etanol a 70% (v/v) durante 10 minutos à temperatura ambiente para reduzir a autofluorescência tecidual.</li>
		<li>Lave o tecido com água deionizada abundante. Monte as corrediças no meio de montagem.</li>
		<li>Obtenha imagens das amostras com um microscópio confocal de varredura a laser.</li>
	</ol></li>
</ol>

Um novo biorreator impresso em 3D para cultura ex vivo de vasos sanguíneos em perfusão

<ol>
	<li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atherosusceptible+endothelium:+Endothelial+phenotypes+in+complex+haemodynamic+shear+stress+regions+in+vivo.">The atherosusceptible endothelium: Endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo.</a> Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).</li><li>Gugliandolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylethanolamide+and+Polydatin+combination+reduces+inflammation+and+oxidative+stress+in+vascular+injury.">Palmitoylethanolamide and Polydatin combination reduces inflammation and oxidative stress in vascular injury.</a> Pharmacological Research. 123, 83-92 (2017).</li><li>Anselmino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catheter+ablation+of+atrial+fibrillation+in+patients+with+left+ventricular+systolic+dysfunction:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Catheter ablation of atrial fibrillation in patients with left ventricular systolic dysfunction: A systematic review and meta-analysis.</a> Circulation, Arrhythmia, and Electrophysiology. 7 (6), 1011-1018 (2014).</li><li>Viola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+delivery+of+monoclonal+antibodies:+How+do+we+get+there.">Subcutaneous delivery of monoclonal antibodies: How do we get there.</a> Journal of Controlled Release. 286, 301-314 (2018).</li><li>Kim, D. 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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Os sistemas de perfusão vascular ex vivo constituem uma plataforma única para estudar a função e o comportamento das células vasculares dentro de seus tecidos nativos sob condições controladas, o que possibilita a dissecção de processos complexos como o remodelamento vascular pós-lesão22. No entanto, a maioria dos biorreatores relatados são sistemas fabricados internamente baseados em componentes feitos sob medida e muitas vezes são difíceis de replicar por outros23. Soluções comerciais alternativas existem, mas carecem de flexibilidade no projeto e podem ser relativamente dispendiosas24.
Desenvolvemos um sistema alternativo que fornece uma plataforma fácil, barata e reprodutível que pode ser fabricada usando técnicas de impressão 3D de código aberto13. O presente artigo descreve a configuração do sistema para habilitar aplicativos reproduzíveis por usuários finais. Essa configuração permite a aplicação de condições fisiológicas e patológicas de pressão (40-180 mmHg), vazão (6-30 mL/min) e em combinação com meios que mimetizam a viscosidade sanguínea, com graus variados de tensão de cisalhamento.
A reprodutibilidade é um aspecto essencial do processo científico, pois permite que os pesquisadores validem os achados de outros e construam sobre eles para avançar nossa compreensão das doenças vasculares. Além disso, ferramentas que possibilitem e promovam colaborações entre grupos são essenciais para o avanço do conhecimento científico. O EasyFlow representa um exemplo dessas soluções acessíveis e de código aberto que podem ser facilmente produzidas e adotadas por laboratórios que trabalham em uma ampla gama de projetos dentro do campo das ciências vasculares e além.
Relatamos que essa cultura do dispositivo mantém a viabilidade do tecido arterial por pelo menos 7 dias, podendo ser usada para modelar etapas específicas da doença vascular. Com isso, pode-se modelar as condições fisiológicas de fluxo e pressão13. É importante ressaltar que essa cultura de perfusão é custo-efetiva devido ao baixo custo de produção e ao baixo volume de meio necessário para operar o sistema.
O design 3D também pode ser adaptado a novas aplicações, e novos materiais para impressão podem ser testados. Mesmo em seu formato atual, o espaço de alojamento de amostras pode ser facilmente adaptado a amostras de diferentes tamanhos, alterando o comprimento dos encaixes ou o furo dos conectores luer. É importante notar que, dada a natureza modular do dispositivo e suas pequenas dimensões, este biorreator pode ser usado em vários setups (Figura 5) e pode ser aplicado em culturas multiplex, onde várias amostras podem ser expostas a diferentes condições ao mesmo tempo em biorreatores separados.
Prevê-se que o uso do sistema seja expandido no futuro para apoiar a cultura de vasos sanguíneos de diferentes origens (por exemplo, diferentes espécies) e de diferentes naturezas (por exemplo, veias, linfáticos), e talvez aplicado à cultura de outros tecidos ocos (por exemplo, traqueia, intestino). Em particular, pesquisas mostram que a cultura de arcabouços teciduais em perfusão constante auxilia na distribuição homogênea das células dentro da construção e maturação do tecido resultante25,26. Além disso, a semeadura dos enxertos vasculares em perfusão contribui para a obtenção de uma luz vascular mais uniformemente celularizada, em comparação com os métodosestáticos27. Por essa razão, vislumbramos que o sistema seja aplicado à engenharia de tecidos para ajudar a enfrentar os desafios atuais, permitindo o desenvolvimento futuro de substitutos sintéticos reprodutíveis dos vasos sanguíneos28.
O protocolo aqui descrito apresenta alguns passos importantes críticos para o sucesso da cultura de fluxo. Estabelecer e monitorar condições adequadas de escoamento não é trivial e precisa ser realizado em cada sistema quando ele é montado pela primeira vez, para garantir que as condições de cultura sejam fisiológicas. O fluxo e a pressão foram monitorados por meio de sensores de pressão e imagens de ultrassom. Outro ponto crítico é garantir que o tecido esteja viável e intacto no início da cultura. Isso requer uma fonte fresca, manuseio cuidadoso e pode ser verificado por análise histológica. Além disso, a solução de problemas deve ser executada no início de cada experimento para identificar qualquer potencial contaminação bacteriana ou fonte de vazamento de mídia.
É importante ressaltar que o sistema de perfusão descrito, embora forneça condições fisiológicas de pressão e fluxo, é incapaz de mimetizar inteiramente os complexos padrões de onda de pressão registrados in vivo. Essa limitação é atribuível ao uso de bomba peristáltica e pode ser resolvida com o uso de equipamentos mais especializados para reproduzir condições hemodinâmicas avançadas. A cultura de vasos sanguíneos em um biorreator também é incapaz de abordar estudos em que o sistema imunológico ou a interação com outros órgãos é crítica.
Em conclusão, é apresentado um sistema de perfusão impresso em 3D simples que pode mimetizar o ambiente hemodinâmico fisiológico, o que deve contribuir para a padronização de culturas de vasos sanguíneos ex vivo . Seu potencial de customização e aplicação em cultura de longo prazo o torna uma ferramenta essencial para o avanço da compreensão desses complexos sistemas biológicos em fisiologia e condições patológicas.

A parede vascular existe em estado estacionário reativo, o que garante tanto responsividade a estímulos externos (i.e., mudança de pressão, vasoconstritores) quanto uma superfície consistente e não ativadora, impedindo a coagulação sanguínea e a infiltração de células inflamatórias1. Em resposta a estímulos dependentes do envelhecimento e do estilo de vida e mediante dano direto, a parede vascular ativa processos de remodelação como reestenose e aterosclerose, que são conhecidos contribuintes para doenças cardiovasculares (DCV) comuns, como acidente vascular cerebral isquêmico e infarto do miocárdio2. Embora abordagens intervencionistas, como revascularização percutânea e implante de stent, estejam disponíveis para combater manifestações avançadas de doença vascular, elas são conhecidas por provocar mais danos vasculares, muitas vezes levando à recorrência. Além disso, apenas estão disponíveis soluções preventivas e em fase inicial limitadas. A compreensão dos mecanismos que mantêm a homeostase da parede vascular e impulsionam sua disfunção está no cerne do desenvolvimento de novas curas3.
Apesar do constante desenvolvimento e avanços na biologia molecular e engenharia de tecidos, os estudos em animais continuam sendo um componente crucial dos estudos de biologia vascular. Estudos in vivo em animais têm fornecido enorme insight sobre os mecanismos da homeostase e patologia vascular; no entanto, esses procedimentos são caros, têm rendimento relativamente baixo e apresentam problemas éticos substanciais. Além disso, animais de pequeno porte são pouco representativos da fisiologia vascular humana, e experimentos com animais maiores são muito mais caros e criam considerações éticas adicionais 4,5. Com a crescente demanda por soluções farmacêuticas e médicas para uma população em rápido envelhecimento, as desvantagens do uso de animais são ampliadas, impactando a reprodutibilidade, confiabilidade e transferibilidade dos resultados para o cuidado do paciente6.
Os sistemas in vitro oferecem uma plataforma simplificada para o estudo de mecanismos básicos, mas não conseguem recapitular a complexidade de todo o tecido, as interações entre as células e a matriz extracelular e as forças mecânicas, que são determinantes críticos no desenvolvimento de doenças vasculares7.
Estudos ex vivo realizados em tecidos inteiros mantidos em ambientes artificialmente controlados mimetizam a complexidade in vivo, ao mesmo tempo em que permitem investigações de rendimento relativamente alto8. Dada a capacidade de controlar de perto as condições de cultivo e o ambiente, os modelos ex vivo permitem uma ampla gama de estudos complexos e fornecem uma alternativa adequada para reduzir o uso de procedimentos animais em biologia vascular. As culturas estáticas dos anéis vasculares ofereceram informações interessantes, mas falharam em incorporar o elemento hemodinâmico crucial9. De fato, o estudo do sistema vascular ex vivo apresenta desafios específicos relacionados às muitas forças dinâmicas que se aplicam às células dentro da parede dos vasos sanguíneos. Estímulos como fluxo luminal, turbulência, tensão de cisalhamento, pressão e deformação da parede afetam significativamente a fisiopatologia tecidual10,11,12.
Os biorreatores de perfusão são essenciais para o estudo da homeostase e remodelamento vascular em resposta a lesões ou alterações hemodinâmicas13. Além disso, a cultura de perfusão pode ser utilizada para melhorar a maturação e a durabilidade dos vasos sanguíneos manipulados por tecidos (TEBVs), fornecendo alternativas adequadas para enxertos vasculares14.
Os biorreatores de perfusão comercialmente disponíveis são limitados em flexibilidade e adaptabilidade e são dispendiosos. Muitos dos biorreatores desenvolvidos internamente são difíceis de replicar em outros laboratórios, devido às descrições limitadas e à indisponibilidade de componentes especialmente fabricados 7,8,9,10,11,12. Para superar essas limitações, desenvolvemos recentemente um novo biorreator (EasyFlow), que é econômico de produzir, acomoda uma variedade de tecidos e permite modificações relativamente simples para se adaptar a diferentes demandas de pesquisa13. A pastilha é impressa em 3D e se encaixa como em uma tampa de um tubo de centrífuga padrão de 50 mL. Seu design modular e fabricação de impressão 3D o tornam acessível e reprodutível em diferentes laboratórios, bem como facilmente modificável para se adaptar a diferentes necessidades científicas. Este protocolo descreve a montagem e operação básica do sistema de biorreator em ambiente de perfusão arterial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EasyFlow</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA12 - 3D printing</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>&#160;PD5201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media components:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran&#160; from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8802-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat &#945;-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;eBioscience Fluoromount G</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-187-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX35 Premier + Microtome Blade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3052835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cooling Tempearure Compound - OCT</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit &#945;-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-203760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90&#176; Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor&#174; 647-conjugated antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC1420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for laser cutting of components:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of&#160; washers)</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>258-6590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of&#160; silicone seals)</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>840-5541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional pressure monitors:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensor</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>080-699PSX-3P-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SciPres Pressure Monitor</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>206-200-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-sterilized single use plasticware:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 um filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1114.210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Sterile syringe</td>
			<td>IMS Euro</td>
			<td>40004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sarstedt - 62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small components:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable ties</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-30800-10</td>
			<td>Barb Adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex&#160;Polycarbonate Luer Fittings</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>AU-45504-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Miniature Check Valve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>98553-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of&#160; silicone seals)</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>840-5541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel M2 Hex Nuts</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>527-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel M2 x 6 mm Screws</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>418-7426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel M5 Hex Nuts</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>189-585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical vessel loop</td>
			<td>Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies</td>
			<td>&#160;10-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way valves</td>
			<td>IMS Euro</td>
			<td>&#160;91000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07</td>
			<td>International Medical Supplies</td>
			<td>SKU: BD-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm</td>
			<td>International Medical Supplies</td>
			<td>SKU: BD-361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm</td>
			<td>International Medical Supplies</td>
			<td>SKU: FD-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troge Surgical Scalpels - Size 23 - Box of 100</td>
			<td>International Medical Supplies</td>
			<td>63114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M0740-2396</td>
			<td>System tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex&#160;PharMed BPT 3-Stop Tubing</td>
			<td>ISMATEC</td>
			<td>95714-48</td>
			<td>Soft wall tubing (for clamp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>667-8432</td>
			<td>Resistance tubing&#160;(small inner diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm)</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>525-30027-00-0</td>
			<td>One way valve tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>125-4042</td>
			<td>Pump Tubing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo perfusion culture of large blood vessels in a 3d printed bioreactor

A doença vascular constitui a base da maioria das doenças cardiovasculares (DCV), que continuam sendo a principal causa de mortalidade e morbidade em todo o mundo. Intervenções cirúrgicas e farmacológicas eficazes para prevenir e tratar a doença vascular são urgentemente necessárias. Em parte, a escassez de modelos translacionais limita a compreensão dos processos celulares e moleculares envolvidos na doença vascular. Biorreatores de cultura de perfusão ex vivo fornecem uma plataforma ideal para o estudo de grandes vasos animais (incluindo humanos) em um ambiente dinâmico controlado, combinando a facilidade de cultivo in vitro e a complexidade do tecido vivo. A maioria dos biorreatores é, no entanto, de fabricação personalizada e, portanto, de difícil adoção, limitando a reprodutibilidade dos resultados. Este trabalho apresenta um sistema impresso em 3D que pode ser facilmente produzido e aplicado em qualquer laboratório biológico, e fornece um protocolo detalhado para sua configuração, possibilitando a operação dos usuários. Este inovador e reprodutível sistema de cultura de perfusão ex vivo permite o cultivo de vasos sanguíneos por até 7 dias em condições fisiológicas. Esperamos que a adoção de um biorreator de perfusão padronizado possa apoiar uma melhor compreensão dos processos fisiológicos e patológicos em grandes vasos sanguíneos de animais e acelerar a descoberta de novas terapêuticas.

The vascular wall exists in a reactive steady state, which ensures both responsivities to external stimuli (i.e., change of pressure, vasoconstrictors) and a consistent non-activating surface preventing blood coagulation and inflammatory cell infiltration1. In response to aging- and lifestyle-dependent stimuli and upon direct damage, the vascular wall activates remodeling processes such as restenosis and atherosclerosis, which are known contributors to common cardiovascular diseases (CVDs), such as ischemic stroke and myocardial infarction2. While interventional approaches such as percutaneous revascularisation and stenting are available to tackle advanced manifestations of vascular disease, these are known to provoke further vascular damage, often leading to recurrence. In addition, only limited preventative and early-stage solutions are available. Understanding the mechanisms maintaining vascular wall homeostasis and driving its dysfunction is at the heart of developing new cures3.
Despite the constant development and advances in molecular biology and tissue engineering, animal studies remain a crucial component of vascular biology studies. In vivo animal studies have provided enormous insight into the mechanisms of vascular homeostasis and pathology; however, these procedures are costly, have relatively low throughput, and pose substantial ethical issues. In addition, small animals are poorly representative of human vascular physiology, and larger animal experiments are vastly more expensive and create further ethical considerations4,5. With the increasing demand for pharmaceutical and medical solutions for a rapidly aging population, the downsides of animal use are magnified, impacting the reproducibility, reliability, and transferability of results to patient care6.
In vitro systems offer a simplified platform to study basic mechanisms but fail to recapitulate the complexity of the whole tissue, the interactions between cells and the extracellular matrix, and the mechanical forces, which are critical determinants in the development of vascular diseases7.
Ex vivo studies performed on whole tissues maintained in artificially controlled environments mimic the in vivo complexity while enabling relatively high-throughput investigations8. Given the ability to closely control the culture conditions and environment, ex vivo models allow a broad range of complex studies and provide a suitable alternative to reduce the use of animal procedures in vascular biology. Static vascular ring cultures offered interesting insights but failed to incorporate the crucial hemodynamic element9. Indeed, the study of the vascular system ex vivo poses specific challenges related to the many dynamic forces which apply to the cells within the blood vessel wall. Stimuli such as luminal flow, turbulence, shear stress, pressure, and wall deformation significantly impact tissue pathophysiology10,11,12.
Perfusion bioreactors are essential for studying vascular homeostasis and remodeling in response to injury or hemodynamic changes13. Furthermore, perfusion culture can be used to improve the maturation and durability of tissue-engineered blood vessels (TEBVs), providing suitable alternatives for vascular grafts14.
Commercially available perfusion bioreactors are limited in flexibility and adaptability and are costly. Many of the existing in-house developed bioreactors are instead difficult to replicate in other labs, due to the limited descriptions and unavailability of specially made components7,8,9,10,11,12. To overcome these limitations, we have recently developed a new bioreactor (EasyFlow), which is economical to produce, accommodates a range of tissues, and enables relatively simple modifications to adapt to different research demands13. The insert is 3D printed and fits as in a lid of a standard 50 mL centrifuge tube. Its modular design and 3D printing manufacture make it accessible and reproducible across different labs, as well as easily modifiable to adapt to different scientific needs. This protocol describes the assembly and basic operation of the bioreactor system in an arterial perfusion setting.

Autor em destaque: EasyFlow - Um biorreator de perfusão econômico e adaptável para cultura de grandes vasos sanguíneos 

Ex Vivo Cultura de Perfusão de Grandes Vasos Sanguíneos em Biorreator Impresso em 3D

We developed a simple cost-effective and adaptable bioreactor for the culture of blood vessels in vitro. The application of physiological flow and pulsatile forces to blood vessels ensures that the cells within the tissue remain viable. The application of bioreactors, such as the one we described here, enable the culture of blood vessels ex vivo and reduces the reliance on animal experiments in research.The application of hemodynamic forces is crucial to maintain a healthy blood vessel in culture, while profusion bioreactors are a great solution to achieve this dynamic environment. Systems described in the existing literature are often challenging to replicate, expensive, and not easy to adapt. We have developed a new perfusion system titled EasyFlow.This system is economic to produce, accommodates a different range of tissues, and is simple to modify so researchers can adapt it to their experimental needs. The production is open source, based on a 3D model, and is accessible through the paper. Also, it can be adapted to the needs of the research based on this 3D model.EasyFlow is currently being employed to test mechanism of vascular repair, such as stem cells or biomaterial-based therapies. We also aim to use this bioreactor to induce the maturation of tissue-engineered blood vessels.

Este estudo estabeleceu um sistema de perfusão versátil e acessível (EasyFlow)13. O design impresso em 3D do sistema facilita a adoção do sistema por outros laboratórios e, portanto, incentiva a reprodutibilidade.
A pastilha de perfusão fabricada é alojada em um tubo centrífugo de 50 mL, criando um ambiente isolado. Usando duas pastilhas de perfusão, pode-se estabelecer uma alça de perfusão contendo um reservatório e uma câmara de reação, onde a amostra biológica é incubada. O sistema de perfusão é então conectado a uma bomba peristáltica e a sistemas opcionais de aquisição, como sensores de pressão e aparelhos de ultrassom, para monitorar as condições de cultura (Figura 2).
Amostras da artéria carótida porcina foram coletadas e processadas antes de serem cultivadas em perfusão por 7 dias. Para garantir a qualidade do tecido antes da cultura, foram realizados experimentos preliminares onde as amostras foram fixadas no momento da excisão, após o preparo do tecido e após a perfusão. A coloração fluorescente para marcadores endoteliais (CD31) e de músculo liso (αSMA) foi utilizada para avaliar a manutenção da integridade tecidual. Exemplos de tecidos bem preservados e lesados são apresentados na Figura 3 para comparação. As imagens mostram a importância do manuseio suave do tecido no momento da excisão, pois o processamento incorreto (estiramento excessivo, esmagamento, etc.) pode resultar em perda do endotélio antes da cultura. Os resultados também mostram a importância do estabelecimento gradual da perfusão para evitar danos luminais.
A coloração H&E foi realizada juntamente com a coloração por imunofluorescência (IF) para mostrar a manutenção da morfologia e distribuição global das células na parede do vaso após 7 dias de cultura (Figura 4). A aplicação de condições fisiológicas de cultura no dispositivo garante a manutenção da cobertura endotelial do lúmen, o alinhamento das células musculares lisas na média e a preservação dos vasa vasorum na adventícia.
O design compacto e modular do sistema de biorreator também permite uma ampla gama de configurações do sistema. O arranjo menor compreende um único biorreator e é ideal para estudos farmacológicos e de baixo volume (perfusão recirculante20, volume total de 50-70 mL). Para aumentar o tempo de cultura e reduzir o número de trocas de meios, um sistema de circulação de reservatório único, como o descrito neste protocolo, ou um sistema de alimentação constante é mais ideal, pois possuem um volume maior de meio em circulação. Uma configuração de dupla circulação21 pode ser estabelecida para explorar cenários experimentais onde a localização dos estímulos é crítica. O dispositivo atual também pode ser combinado com sistemas de controle mais sofisticados para permitir o controle preciso por realimentação de parâmetros como pH e oxigênio dissolvido (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65465/65465fig01.jpg"> Figura 1: Esquemas de montagem do EasyFlow. (A) Esquemas renderizados em 3D auxiliando a montagem do inserto de perfusão. (B) Esquemas detalhados são fornecidos para facilitar a montagem dos locais de conexão. (C) Uma visão transversal do espaço de reação destaca os componentes essenciais da inserção EasyFlow e a conexão do tecido à inserção. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65465/65465fig02.jpg"> Figura 2: Representação esquemática da montagem do sistema de perfusão. (A) Sistema de perfusão montado contendo todos os componentes importantes, destacando sua posição relativa em um ambiente renderizado em 3D. Nem todos os componentes são para escalar. (B) Visões isométricas individuais dos componentes também são apresentadas. (C) Uma visão superior do sistema de perfusão montado é mostrada para auxiliar a montagem e conexão dos diferentes componentes. As portas foram rotuladas e numeradas no sentido anti-horário para navegar pelos vários locais de conexão através do sistema de perfusão. Este princípio tem sido aplicado ao reservatório (R) e à câmara de reação (C). Os vários canais que ligam as duas câmaras também receberam nomes para referência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65465/65465fig03.jpg"> Figura 3: Manutenção tecidual durante o processamento. (A) Imagens confocais mostram a estrutura normal de uma artéria no momento da colheita, (B) após limpeza e processamento e (C) após cultura de perfusão, demonstrando a manutenção de uma morfologia bem preservada. (D) Exemplos de tecido danificado devido ao manuseio excessivo ou incorreto durante o processamento ou (E) devido à aplicação de condições de cultura não fisiológicas (isto é, início abrupto de alto fluxo) mostram esgotamento da cobertura luminal e interrupção do meio. (F) O controle negativo indica a especificidade da coloração. CD31: verde; αSMA: vermelho; DAPI: azul. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65465/65465fig04.jpg"> Figura 4: Avaliação histológica do tecido antes e após a cultura de perfusão. (A e B) O tecido arterial foi avaliado por histologia no momento da colheita e (C e D) após 7 dias de cultivo com o sistema de biorreator. (A e C) A coloração H&E revela preservação da estrutura e organização da parede arterial. (B e D) A coloração por imunofluorescência do mesmo tecido evidencia cobertura endotelial, alinhamento de células musculares lisas e vasa vasorum na adventícia. CD31: verde; AME: vermelho; DAPI: azul. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65465/65465fig05.jpg"> Figura 5: Representação esquemática dos possíveis ajustes de perfusão. Vários dispositivos alternativos podem ser acomodados com a pastilha de perfusão para permitir diferentes estudos experimentais. (A) O arranjo de perfusão recirculante minimiza o volume de meio necessário. (B) A instalação de alimentação constante fornece um suprimento constante de meio para o tecido. (C) A circulação de um único reservatório (como descrito neste trabalho) fornece um volume maior de meios para incubações de longa duração e inclui uma zona tampão para troca de ar e equilíbrio de pressão. (D) A configuração da dupla circulação fornece duas alças distintas alimentando as circulações interna (dentro da artéria) e externa (espaço de reação) de forma independente. (E) O arranjo dinâmico de perfusão inclui gases contínuos e controle de pH por um controlador de derivada integral proporcional (PID). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Componentes para fabricação dos insertos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465_Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Arquivo Suplementar 1: Modelo 3D da pastilha EasyFlow para fabricação de impressão 3D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/Supplementary%20File%201.stl" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 2: Esquemas de projeto do dispositivo construído, visualização de seção, impressão e componentes de vedação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/Supplementary%20File%202.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about EasyFlow  An Economical and Adaptable Perfusion Bioreactor for Large Blood Vessel Culture at JoVE.com

Este protocolo apresenta a instalação e operação de um biorreator impresso em 3D recentemente desenvolvido para a cultura ex vivo de vasos sanguíneos em perfusão. O sistema foi projetado para ser facilmente adotado por outros usuários, prático, acessível e adaptável a diferentes aplicações experimentais, como biologia básica e estudos farmacológicos.

Vascular disease forms the basis of most cardiovascular diseases (CVDs), which remain the primary cause of mortality and morbidity worldwide. Efficacious ...

Desenvolvemos um biorreator simples, econômico e adaptável para a cultura de vasos sanguíneos in vitro. A aplicação de fluxo fisiológico e forças pulsáteis aos vasos sanguíneos garante que as células dentro do tecido permaneçam viáveis. A aplicação de biorreatores, como o que descrevemos aqui, possibilita o cultivo de vasos sanguíneos ex vivo e reduz a dependência de experimentos animais em pesquisas.A aplicação de forças hemodinâmicas é crucial para manter um vaso sanguíneo saudável em cultura, enquanto os biorreatores de profusão são uma ótima solução para alcançar esse ambiente dinâmico. Os sistemas descritos na literatura existente são muitas vezes difíceis de replicar, caros e não fáceis de adaptar. Desenvolvemos um novo sistema de perfusão intitulado EasyFlow.Este sistema é econômico para produzir, acomoda uma gama diferente de tecidos, e é simples de modificar para que os pesquisadores possam adaptá-lo às suas necessidades experimentais. A produção é open source, baseada em um modelo 3D, e é acessível através do papel. Além disso, pode ser adaptado às necessidades da pesquisa com base neste modelo 3D.Atualmente, o EasyFlow está sendo empregado para testar mecanismos de reparo vascular, como células-tronco ou terapias baseadas em biomateriais. Também pretendemos usar este biorreator para induzir a maturação de vasos sanguíneos manipulados por tecidos.

ex-vivo-perfusion-culture-large-blood-vessels-3d-printed

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Ex Vivo Perfusion Culture of Large Blood Vessels in a 3D Printed Bioreactor

2.0K visualizações.  University of Surrey. Desenvolvemos um biorreator simples, econômico e adaptável para a cultura de vasos sanguíneos in vitro. A aplicação de fluxo fisiológico e forças pulsáteis aos vasos sanguíneos garante que as células dentro do tecido permaneçam viáveis. A aplicação de biorreatores, como o que descrevemos aqui, possibilita o cultivo de vasos sanguíneos ex vivo e reduz a dependência de experimentos animais em pesquisas.A aplicação de forças hemodinâmicas é crucial para manter um vaso...

Vídeo: Autor em destaque: EasyFlow - Um biorreator de perfusão econômico e adaptável para cultura de grandes vasos sanguíneos 

Vascular disease forms the basis of most cardiovascular diseases (CVDs), which remain the primary cause of mortality and morbidity worldwide. Efficacious surgical and pharmacological interventions to prevent and treat vascular disease are urgently needed. In part, the shortage of translational models limits the understanding of the cellular and molecular processes involved in vascular disease. Ex vivo perfusion culture bioreactors provide an ideal platform for the study of large animal vessels (including humans) in a controlled dynamic environment, combining the ease of in vitro culture and the complexity of the live tissue. Most bioreactors are, however, custom manufactured and therefore difficult to adopt, limiting the reproducibility of the results. This paper presents a 3D printed system that can be easily produced and applied in any biological lab, and provides a detailed protocol for its setup, enabling users&#39; operation. This innovative and reproducible ex vivo perfusion culture system enables the culture of blood vessels for up to 7 days in physiological conditions. We expect that adopting a standardized perfusion bioreactor will support a better understanding of physiological and pathological processes in large animal blood vessels and accelerate the discovery of new therapeutics.

This protocol presents the setup and operation of a newly developed, 3D printed bioreactor for the ex vivo culture of blood vessels in perfusion. The system is designed to be easily adopted by other users, practical, affordable, and adaptable to different experimental applications, such as basic biology and pharmacological studies.

Bioengenharia

Assembly and Priming of the 3D-Printed Bioreactor for Perfusion Culture

Begin assembling the bioreactor under laminar flow by first assembling the two 3D printed easy flow inserts. Then using one insert as the reservoir, and the other as the reaction chamber, proceed to assemble the perfusion system. Attach two connected three-way valves to the reservoir R1 port using a system tube equipped with a one-way valve.Connect the resulting outlet with the pump head. Then connect the pump head to the reaction chamber's C4 port using similar tubing with a one-way valve. Next, connect the reaction chamber port C1 via soft wall tubing to the resistance channel with a smaller inner diameter.Create a perfusion return channel by extending the resistance channel with the system tubing, and closing the luminal circulation loop by connecting to the reservoir at R5.Create an overflow channel by connecting the reaction chamber port C3 to the reservoir port R3 using system tubing, Attach a ventilator filter through R2.Construct a pressure dampener by connecting a syringe filled with air and media to the reaction chamber C6.Using a perfusion media, prime the system through the media exchange ports and the reservoir.

Montagem e Condicionamento Fisiológico do Biorreator Impresso em 3D para Cultura de Perfusão

Perfusion Culture of Blood Vessels in the 3D-Printed Bioreactor

To prepare the sample for perfusion culture using the 3D-printed bioreactor. In a laminar flow cabinet, place the isolated porcine carotid artery samples in cold transport media. Using a scalpel blade, remove excess connective tissue and trim the ends of the tissue.Then wash the tissue twice in cold transport media. Next, place the tissue in transport media on an orbital shaker for a minimum of 30 minutes for a thorough final washing. After that, connect a non-branching segment of the washed artery to the fabricated bioreactor system using two barbed lure connections.And secure it using a vessel bond made of vascular silicone ties. Using a small syringe attached to the first lure connection, gently flow media through the artery to ensure its patency. After securing the artery to the fabricated insert, fill the reaction space with perfusion media.Next, carefully fill the luminal circulation loop with media, removing any remaining air from the system. Lastly, connect the reaction space to the assembled perfusion system, completing the circulation. To perform the perfusion culture, place the perfusion system in an incubator.After connecting it to a peristaltic pump, connect any additional acquisition systems, such as pressure sensors. Allow the system to equilibrate overnight with a low media flow rate of approximately 10 to 15 milliliters per minute. The following day, incrementally increase the flow until a final flow rate of 35 milliliters per minute is achieved.Every three days, replace 50%of the media by connecting one syringe with fresh media to the media exchange port closer to the pump and an empty syringe to the port closer to the reservoir to collect the spent medium. After the experiment, using sterile surgical scissors, harvest the tissue from the reaction chamber by trimming the tissue ends connected to the bioreactor. Confocal imaging using endothelial and smooth muscle-specific markers revealed that the normal structure of an artery was well preserved and maintained throughout, starting from the time of harvest, to cleaning and processing, and even after perfusion culture.However, incorrect handling during processing resulted in the loss of the endothelium ahead of the culture, and the application of non-physiological culture conditions like abrupt initiation of high flow showed luminal damage. Histological evaluation of the tissue using hematoxylin and eosin staining and immunofluorescence staining at the time of harvest and after seven days of perfusion culture revealed that the morphology and overall distribution of the cells in the vessel wall were maintained throughout.