Die Finanzierung durch das Stipendium des Appalachian State University Research Council (URC) und das CAPES Print Travel-Stipendium, das den Besuch der FAO an der Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto - São Paulo, Brasilien, unterstützte, werden dankbar gewürdigt. Diese Studie wurde teilweise von der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finanzcode 001 finanziert. Das ECPDM ist dankbar für das CAPES Print Travel Stipendium, das ihren Besuch an der Appalachian State University unterstützte. Das ECPDM ist Research Fellow 2 des Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasilien (CNPq).

1. Experimentelle Weinproduktion
<ol><li>Beziehen Sie Traminnette-Trauben von Dynamis Estate-Wein im Weinberg Jonesville, North Carolina, entrappen und zerkleinern, um den Most in zwei separate offene 600-Liter-Gärbehälter zu geben und etwa 4 Tage lang mit aufgesetzten Deckeln auf den Schalen zu belassen.</li>
	<li>Schlagen Sie die Kappen einmal täglich nach unten, um die Haut feucht zu halten und die Produktion flüchtiger Säuren (VA) zu begrenzen. HINWEIS: Die Idee ist, dass sich viele der aromatischen Vorläufer (Monoterpene) in den Schalen befinden und den Saft in Kontakt mit der Haut lassen, um das aromatische Potenzial des Weins zu erhöhen.</li>
	<li>Nach 4 Tagen Pech Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Diese Hefe wurde ausgewählt, da sie ein starker Gärer ist und mit der Verbesserung des Sortencharakters im Wein aus den Trauben verbunden ist.</li>
	<li>In einem Tank, Traminette R, 20 g/hL Fermaid O bei einem Brix von 17,7 und 20 g/hL Fermaid O und 12,5 g/hL Fermaid K bei 13,1 g/hL hinzufügen, um Gärsicherheit zu erreichen, während im anderen Tank, Traminette L, 40 g/hL Stimula Sauvignon blanc bei einem Brix von 17,1 hinzugefügt werden. Bei einem Brix-Wert von 13,4 auch 20 g/hL Fermaid O hinzufügen, um den Sortencharakter des Weins zu verbessern.</li>
	<li>Doppelte Proben von Most (Tag 1), hinzugefügter Hefe (Tag 4), fermentiertem Most (Tag 15) und fertigen Weinproben (Tag 30) entnehmen und vor der DNA-Extraktion und metagenomischen Analyse bei -20 °C aufbewahren.</li>
</ol>2. DNA-Extraktion für die Metagenomik
<ol><li>Bewahren Sie alle oben gewonnenen doppelten Proben bis zur ersten Zentrifugation auf Eis auf.</li>
	<li>20 ml der fermentierten Probe werden in ein steriles 50-ml-Schraubverschlussröhrchen überführt.</li>
	<li>10 ml kaltes Wasser hinzufügen und homogenisieren (Vortex). 1 min bei 800 x g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand in ein neues 50-ml-Röhrchen überführen. HINWEIS: In diesem Schritt werden die Feststoffe der Probe entfernt.</li>
	<li>Schritt 2.3 zweimal wiederholen und die Überstände im selben Röhrchen bündeln.</li>
	<li>Überstand bei 3.000 x g bei 4 °C 20 min zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Das Pellet in 1 ml PBS resuspendieren, in ein 2-ml-Schraubverschlussröhrchen umfüllen und 2 Minuten lang bei 14.000 x g zentrifugieren. Führen Sie zwei weitere Wäschen mit PBS durch.</li>
	<li>Frieren Sie die Pellets in diesem Schritt bei -20 °C ein oder befolgen Sie Schritt 2.8. Es ist wichtig, dass alle Proben gleich behandelt werden.</li>
	<li>Fügen Sie 978 μl Natriumphosphatpuffer hinzu. Natriumphosphatpuffer herstellen, 3,1 g NaH2PO4· H2O und 10,9 g Na2HPO4 (wasserfrei) zu destilliertem H2O zu einem Volumen von 1 l und pH-Wert auf 7,4 einstellen.</li>
	<li>122 μl DNA-Puffer (DNA-Spin-Kit) hinzufügen und vortexen.</li>
	<li>Im Kühlschrank (4 °C) 45 min-1 h stehen lassen. Wirbeln Sie die Proben alle 15 min. Dieser Schritt kann über Nacht (o/n) oder bis zur weiteren Verwendung des DNA-Spin-Kits belassen werden.</li>
	<li>Übertragen Sie 1 ml Probe in ein Lyselösungsröhrchen 1 (DNA-Spin-Kit) und ziehen Sie die Kappe fest (schreiben Sie die Probennummer auf die Seite des Röhrchens und nicht auf die Kappe; die Kit-Reagenzien entfernen alles, was auf der Kappe steht).</li>
	<li>Die Probe wird in einem Perlbrecher (6,5 m/s, CY: 24 x 2) dreimal 60 s lang homogenisiert. Wenn die Perlmühle über die Vorrichtung zum Einfüllen von Eis verfügt, geben Sie 50 g Trockeneis unter die Röhrchen. Wenn nicht, bewahren Sie die Proben zwischen den einzelnen Homogenisierungsschritten 5 Minuten lang auf nassem Eis auf.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Lysing Matrix E-Röhrchen (DNA-Spin-Kit) für 1 Minute bei 16800 x g (oder maximaler Geschwindigkeit).</li>
	<li>Den Überstand in ein sauberes Mikroröhrchen geben. Fügen Sie danach 250 μl Reagenz für Proteinfällungslösung (PPS) (DNA-Spin-Kit) hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen 10 Mal von Hand schütteln.</li>
	<li>5 min bei 16800 x g zentrifugieren, um den Niederschlag zu pelletieren.</li>
	<li>Den Überstand in ein steriles 15-ml-Röhrchen überführen. Geben Sie 1 ml Bindungsmatrixsuspension (DNA-Spin-Kit) in den Überstand. HINWEIS: Suspendieren Sie die Bindungsmatrixsuspension vor der Verwendung, bis sie homogen ist.</li>
	<li>Drehen Sie die Röhrchen 2 Minuten lang von Hand um und lassen Sie die Röhrchen dann 3 Minuten lang in einem Gestell stehen (damit sich die Kieselsäurematrix absetzen kann).</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig 1 ml des Überstands. Die Matrix wird im verbleibenden Überstand resuspendiert.</li>
	<li>600 μl der Mischung in ein Spin-Filterröhrchen (DNA-Spin-Kit) überführen und 1 min bei 14500 x g zentrifugieren.</li>
	<li>Die restliche Mischung hinzufügen und zentrifugieren.</li>
	<li>Durchfluss dekantieren und 500 μl Waschlösung (DNA-Spin-Kit) in das Schleuderfilterröhrchen geben und 1 Minute bei 14500 x g zentrifugieren (EtOH zur Waschlösung hinzufügen; siehe Produkthandbuch). Dekantieren Sie den Durchfluss und wiederholen Sie die Wäsche noch zwei weitere Male (insgesamt 3 Wäschen).</li>
	<li>Dekantieren Sie den Durchfluss und zentrifugieren Sie weitere 2 Minuten bei 14.500 x g , um die Matrix der restlichen Waschlösung zu trocknen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Schleuderfilter und legen Sie ihn in ein frisches Auffangröhrchen (DNA-Spin-Kit). Trocknen Sie den Schleuderfilter 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) an der Luft.</li>
	<li>Erwärmen Sie das DNAse-freie Wasser (DNA-Spin-Kit) bei 55 °C für 5 min. Fügen Sie 50 μl DNAse-freies Wasser hinzu und rühren Sie die Matrix vorsichtig mit einer Pipettenspitze auf der Filtermembran um, um eine effiziente Elution der DNA zu erzielen. Lassen Sie die Proben 1 Minute lang bei RT stehen und zentrifugieren Sie sie dann 1 Minute lang bei 14500 x g , um die DNA zu eluieren.</li>
	<li>Legen Sie die Proben auf Eis. Laden Sie die Probenmischung (2 μl Probe + 2 μl Wasser + 1 μl Ladepuffer) in ein Gel. Messen Sie die DNA-Konzentration.</li>
	<li>Lagern Sie die Proben bei -20 °C.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die extrahierte DNA zu quantifizieren. HINWEIS: Ein Volumen von 1 μl DNA wurde fallen gelassen und quantifiziert, und die Qualität der DNA wurde in einem Verhältnis von A260/A280 festgestellt.</li>
</ol>3. DNA-Elektrophorese
<ol><li>Bereiten Sie 1% Agarose-Gel in 0,5 Tris/Borat/EDTA (FSME)-Puffer vor (20 ml für ein Mini-Gel, 70-100 ml für ein mittleres Gel). Agarose + Puffer wiegen, in der Mikrowelle kochen, um Agarose zu schmelzen, erneut wiegen und dH2O zum Originalgewicht hinzufügen. Die Agaroselösung auf 55-60 °C abkühlen lassen und in den Gelbildner mit Kammaufbau gießen. Lassen Sie das Gel fest werden.</li>
	<li>Geben Sie 1 μl 10x Gelladepuffer in die Probe (10 μl) und laden Sie es neben einem Molekulargewichtsmarker auf das Gel. Von negativ (schwarz) nach positiv (rot) bei 100-115 V (großes Gel) oder 90 V (Mini-Gel) laufen, bis sich der blaue Farbstoff in der Nähe des Bodens befindet.</li>
	<li>Färben Sie das Gel 30 Minuten lang in 1 μl/ml Ethidiumbromid oder SYBR-Grün (Nitrilhandschuhe und Schutzbrille erforderlich), spülen Sie es in Wasser ab und betrachten Sie es unter einer ultravioletten (UV) Lichtquelle. Wählen Sie aus den doppelten Proben die höchste Ausbeute für die weitere Verarbeitung aus.</li>
</ol>4. Hochdurchsatz-Sequenzierung
<ol><li>Amplifizieren Sie die hypervariable V4-Region des 16S rRNA-Gens mit den spezifischen Primern 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') und 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. Stellen Sie die Bedingungen für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf 94 °C für 2 min, 30 Zyklen von 94 °C für 20 s, 58 °C für 20 s, 65 °C für 1 min und 65 °C für 10 min (letzte Verlängerung) ein.</li>
	<li>Führen Sie PCR-Reaktionen mit einem High-Fidelity-PCR-Mastermix durch (Table of Materials).</li>
	<li>Generieren Sie Bibliotheken mit einem DNA-Bibliotheksvorbereitungskit und sequenzieren Sie dann mit Paired-End-Sequenzierung auf einer Sequenzierungsplattform. HINWEIS: Hier wurden die mit dem NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit generierten Bibliotheken mittels Paired-End-Illumina-Sequenzierung (2 × 250 bp) auf der novaseq6000-Plattform sequenziert.</li>
	<li>Befolgen Sie die Sequenzierungsschritte:<ol><li>Schritt 1: Scheren Sie die DNA mit einem Enzym, normalerweise durch eine Methode, die für eine allgemeine Größe selektiert.<ol><li>3,5 μl Sequenzierpuffer und 1,5 μl Enzymmix zu 25 μl DNA (ca. 1 μg) geben, 10 mal mit einer Pipette mischen und schnell schleudern.</li>
			<li>In einen Thermocycler unter folgenden Bedingungen geben: Deckel auf 75 °C vorheizen, (1) 30 min auf 20 °C (2) 30 min auf 65 °C (3) bei 4 °C halten.</li>
		</ol></li>
		<li>Schritt 2: Adapter über Ligation hinzufügen<ol><li>Fügen Sie mit einer Pipette 15 μl Ligations-Mastermix, 1,25 μl Adapter, 0,5 μl Ligationsverstärker und 30 μl End-Prep-DNA-Mix hinzu.</li>
			<li>Inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 20 °C in einem Thermocycler und geben Sie dann 1,5 μl uracilspezifisches Exzisionsreagenz (USER)-Enzym in die Ligationsmischung, um insgesamt 48,26 μl zu erhalten. Inkubieren Sie 37 °C für 15 Minuten.</li>
			<li>Fügen Sie 43,5 μl magnetische Beads zur Adapterligations-DNA hinzu, mischen Sie sie 20 Mal mit einer Pipette und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei RT. Trennen Sie die Beads mit einem Magnetgestell, inkubieren Sie dann 5-10 Minuten lang und entsorgen Sie den Überstand.</li>
			<li>Waschen Sie das Pellet mit 100 μl 80% Ethanol, trocknen Sie es 30 s lang und waschen Sie es erneut. Eluieren Sie die Kügelchen und das Pellet in 8,5 μl 10 mM Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC H20, mischen Sie sie mit einer Pipette und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang bei RT.</li>
			<li>Im Magnetgestell inkubieren und 7,5 μl eluierte DNA als Überstand entfernen. Legen Sie die Elue in ein neues Röhrchen und führen Sie einen PCR-Schritt durch.</li>
			<li>Fügen Sie zunächst 12,5 μl Mastermix, 2,5 μl Index-Primer i7-Primer und 2,5 μl universellen PCR-Primer/i5-Primer zu 7,5 μl adapterligierter DNA hinzu, um 25 μl PCR-Reaktionsmix zu erhalten. Verwenden Sie die folgende PCR-Bedingung: Heizen Sie den Deckel auf 103 °C vor. 98 °C für 30 s, 98 °C für 10 s, 65 °C für 75 s, 65 °C für 5 min und halten Sie ihn nach 10 Zyklen bei 4 °C.</li>
			<li>Reinigen Sie die 25 μl amplifizierte DNA. Fügen Sie 22,5 μl Magnetkügelchen hinzu und mischen Sie 20 Mal. 5 Minuten bei RT inkubieren und 50 μl des Überstands entfernen. Waschen Sie die Kügelchen mit 100 μl 80%igem Ethanol und entfernen Sie das gesamte Ethanol, indem Sie die Kügelchen 30 s lang vorsichtig trocknen.</li>
			<li>Die dunkelbraunen Kügelchen in 16 μl Wasser resuspendieren, 20 Mal mit einer Pipette mischen und für 30-60 s in das Magnetgestell legen. 15 μl in ein neues Röhrchen umfüllen.</li>
			<li>Bestimmen Sie die DNA-Konzentration mit einem Fluorometer. Mischen Sie 90 μl Puffer + 1 μl Farbstoff + 2 μl DNA-Bibliotheksprobe und lesen Sie die Konzentration ab. Verdünnen Sie die DNA auf 2 nM, laden Sie 27-30 μl in die Durchflusszelle und legen Sie sie in den Sequenzierer.</li>
		</ol></li>
		<li>Schritt 3: Sequenzieren Sie die Adapter, hybridisieren Sie die oben generierten Bibliotheken mit der Matrix der gemusterten Durchflusszelle und erfassen Sie DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie es als Vorlage für die zweite Synthese.<ol><li>Amplifizieren Sie dann den zweiten Strang zu einem klonalen Cluster. Linearisieren Sie den Cluster und blockieren Sie die aktiven Standorte. Fügen Sie einen Sequenzierungsprimer hinzu, um einen Ort für die Sequenzierung durch Synthese in der Sequenz gemäß dem Protokoll des Herstellers bereitzustellen. HINWEIS: Chemisch binden die modifizierten Nukleotide durch natürliche Komplementarität an den DNA-Matrizenstrang. Jedes Nukleotid hat eine fluoreszierende Markierung und einen reversiblen Terminator, der den Einschluss der nächsten Base blockiert. Daher zeigt das Vorhandensein eines Fluoreszenzsignals an, welches Nukleotid eingefügt wird, und der Terminator wird gespalten, damit die nächste Base binden kann.</li>
		</ol></li>
		<li>Schritt 4: Amplifizieren Sie den einfach gebundenen Strang, um Cluster von Sequenzen zu erhalten, die durch Synthese zusammen sequenziert werden. HINWEIS: Die Cluster geben durch bidirektionales Scannen und Zweikanal-Sequenzierungschemie ein helleres Signal als ein einzelner Strang. Die Sequenzierungssoftware überträgt Basisaufrufdateien (*.cbcl) automatisch zur Datenanalyse an den angegebenen Ausgabeordnerspeicherort.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Bioinformatik
<ol><li>Generieren Sie die Sequenzdaten als FASTQ-Dateien. Analysieren Sie, um die folgenden Teile einzuschließen.<ol><li>Teil I:<ol><li>Speichern Sie die vom Sequenzer erhaltenen FASTQ-Dateien, klicken Sie, um eine Tabellenkalkulationsdatei zu öffnen, und erstellen Sie Zuordnungs-/Metadatendateien.</li>
			<li>Öffnen Sie die Nephele-Website (https://nephele.niaid.nih.gov/), laden Sie die FASTQ-Dateien hoch, lesen Sie QC, Filtern und Trimmen in QIIME222. Hinterlegung der Rohsequenzen als Sequenzlesearchiv (SRA) und GenBank im NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)</li>
		</ol></li>
		<li>Teil II: Gehen Sie auf die Nephele-Website (https://nephele.niaid.nih.gov/), führen Sie die demultiplexed Paired-End-Lesevorgänge, Filtersubstitution und Chimärenfehler durch und führen Sie mit DADA223 zusammen. Verwenden Sie den Naive Bayes-Klassifikator, der auf der Silva-Datenbank Version 132 99 % OTU trainiert wurde, um eine bakterielle taxonomische Zuordnung bei 97 % Ähnlichkeitdurchzuführen 24.</li>
		<li>Teil III: Öffnen Sie die MicrobiomeDB-Website, klicken Sie, um Dateien hochzuladen, und generieren Sie OTU-Alpha-Diversitäts-, Beta-Diversitäts-, relative Abundanz- und Verdünnungskurven (https://microbiomedb.org/mbio/app).</li>
		<li>Teil IV: Öffnen Sie eine Tabelle und übertragen Sie Daten, um Heatmaps, Venn-Diagramme und lineare Diskriminanzanalyse-Effektgrößen (https://microbiomedb.org/mbio/app) zu erstellen.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Statistische Auswertung
<ol><li>Öffnen Sie QIIME222 und bestimmen Sie die signifikanten Unterschiede in der Alpha-Diversität zwischen Gruppen mit dem Alpha-Gruppen-Signifikanz-Skript. Damit wird auch der Kruskal-Wallis-Test durchgeführt.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Unterschiede in der Beta-Diversität zwischen Gruppen mit PERMANOVA, einschließlich eines paarweisen Tests25.</li>
	<li>Erhalten Sie die signifikanten Unterschiede in der Bakteriengemeinschaftsstruktur zwischen den Gruppen mit MicrobiomeDB. Ein p-Wert ≤0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.</li>
</ol>

Profilierung der bakteriellen Gemeinschaft in Trauben mit Hilfe der Amplikon-Metagenomik

<ol>
	<li>Skinkis, P. A., Bordelon, B. P., Wood, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+monoterpene+constituents+in+traminette,+gew&#252;rztraminer,+and+riesling+winegrapes.">Comparison of monoterpene constituents in traminette, gew&#252;rztraminer, and riesling winegrapes.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 59, 440-445 (2008).</li><li>Bordelon, B. P., Skinkis, P. A., Howard, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+training+system+on+vine+performance+and+fruit+composition+of+Traminette.">Impact of training system on vine performance and fruit composition of Traminette.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 59, 39-46 (2008).</li><li>Reisch, B. 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J., Rodr&#305;&#769;guez-Vico, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+and+oenological+properties+of+wine+yeasts+isolated+during+spontaneous+fermentation+of+six+varieties+of+grape+must.">Molecular characterization and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must.</a> Food Microbiology. 21, 149-155 (2004).</li><li>Attila, K. &. #. 1. 9. 5. ;., Kluz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+microflora+of+wine+grape+berries.">Natural microflora of wine grape berries.</a> Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 4 (special issue 1), 32-36 (2015).</li><li>Swiegers, J. H., Bartowsky, E. J., Henschke, P. A., Pretorius, I. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+viable+grapevine+microbiome+to+enhance+the+quality+of+wild+wines.">Monitoring the viable grapevine microbiome to enhance the quality of wild wines.</a> Microbiology Australia. 44 (1), 13-17 (2023).</li><li>Lorenz, P., Eck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics+and+industrial+applications.">Metagenomics and industrial applications.</a> Nature Reviews Microbiology. 3, 510-516 (2005).</li><li>Tosi, E., Azzolini, M., Guzzo, F., Zapparoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+different+fermentation+behaviours+of+two+indigenous+strains+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+uvarum+isolated+from+Amarone+wine.">Evidence of different fermentation behaviours of two indigenous strains of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum isolated from Amarone wine.</a> Journal of Applied Microbiology. 107 (1), 210-218 (2009).</li><li>Stefanini, I., Cavalier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+approaches+to+investigate+the+contribution+of+the+vineyard+environment+to+the+quality+of+wine+fermentation:+potentials+and+difficulties.">Metagenomic approaches to investigate the contribution of the vineyard environment to the quality of wine fermentation: potentials and difficulties.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 991 (2018).</li><li>Caporaso, J. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DADA2:+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data.">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13, 581-583 (2016).</li><li>Quast, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILVA+ribosomal+RNA+gene+database+project:+improved+data+processing+and+web-based+tools.">The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).</li><li>Anderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+non-parametric+multivariate+analysis+of+variance.">A new method for non-parametric multivariate analysis of variance.</a> Austral Ecology. 26 (1), 32-46 (2001).</li><li>Bolyen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interactive,+scalable+and+extensible+microbiome+data+science+using+QIIME+2.">interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2.</a> Nature Biotechnology. 37, 852-857 (2019).</li><li>Fadiji, A. E., Babalola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics+methods+for+the+study+of+plant-associated+microbial+communities:+A+review.">Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: A review.</a> Journal of Microbiological Methods. 170, 105860 (2020).</li><li>van Hijum, S. A., Vaughan, E. E., Vogel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+state-of-art+sequencing+technologies+to+indigenous+food+fermentations.">Application of state-of-art sequencing technologies to indigenous food fermentations.</a> Current Opinion in Biotechnology. 24, 178-186 (2013).</li><li>V&#237;quez-R, L., Fleischer, R., Wilhelm, K., Tschapka, M., Sommer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumping+the+green+wall:+The+use+of+PNA-DNA+clamps+to+enhance+microbiome+sampling+depth+in+wildlife+microbiome+research.">Jumping the green wall: The use of PNA-DNA clamps to enhance microbiome sampling depth in wildlife microbiome research.</a> Ecology and Evolution. 10 (20), 11779-11786 (2020).</li><li>Bukin, Y. S., Galachyants, P., Yu, I. V., Morozov, S. V., Bukin, A. S., Zakharenko, T. I., Zemskaya, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results.">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6, 190007 (2019).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Das Protokoll der Metagenomik beginnt mit der Probenahme des Traubenmostes, und wenn dem Most Hefe zugesetzt wurde, dem gärenden Wein und der endgültigen Weinprobe. Es folgte eine doppelte DNA-Extraktion, die erfolgreich aus diesen Proben extrahiert wurde. Die erhaltenen Mengen variierten in der Konzentration von 15 ng/μl bis 87 ng/μl. Dies zeigt, dass das DNA-Extraktionsprotokoll für metagenomische Studien von Wein wirksam ist. Obwohl die Qualität der DNA bei A260/A280 variiert, kann dies auf verschiedene Paramete...

Die Traminette-Traube zeichnet sich durch eine Produktion von höchster Weinqualität aus, zusätzlich zu einem beträchtlichen Ertrag und einer teilweisen Resistenz gegen verschiedene Pilzinfektionen 1,2,3. Die natürliche Gärung von Trauben hängt von assoziierten Mikroorganismen, der Weinproduktionsumgebung und den Gärgefäßenab 4,5. Oft verlassen sich viele Weingüter auf wilde Hefen und Bakterien für die Gärung, die Produktion von Alkohol, Estern, Aroma und Geschmacksentwicklung6.
Ziel dieser Studie ist es, die bakterielle Zusammensetzung von Trauben zu untersuchen und ihre Dynamik während der Gärung zu überwachen. Die moderne Verwendung von Starterkulturen wie Saccharomyces cerevisiae für die Primärgärung, bei der Alkohol produziert wird, ist jedoch bei verschiedenen Weinstilen üblich7. Darüber hinaus verbessert die Nachgärung, bei der Apfelsäure von Oenococcus oeni zu Milchsäure decarboxyliert wird, das organoleptische und Geschmacksprofil des Weins und reduziert den Säuregehalt des Weins 8,9. Mit den jüngsten Fortschritten bei der Verwendung kulturunabhängiger Methoden ist es nun möglich, verschiedene Mikroben zu bestimmen, die mit der Keltertraube assoziiert sind, und die Arten, die in den Most überführt werden und zu unterschiedlichen Zeitpunkten bis zum Endprodukt an der Gärung teilnehmen10.
Die Rolle und Dynamik von Wildbakterien aus verschiedenen Trauben, die während der Weingärung auf den Most übertragen werden, sind kaum verstanden. Die Taxonomie vieler dieser Bakterien ist nicht einmal bekannt, oder ihre phänotypischen Eigenschaften sind nicht charakterisiert. Dadurch wird ihre Anwendung in der Kokulturfermentation noch wenig genutzt. Mikrobiologische kulturbasierte Analysen wurden jedoch verwendet, um die Bakterienpopulation zu bestimmen, die mit Trauben und Wein assoziiert ist10. Es ist allgemein bekannt, dass die selektive Kulturbeschichtung langwierig und anfällig für Verunreinigungen ist, eine geringe Reproduzierbarkeit aufweist und die Ergebnisse zweifelhaft sein können. Es fehlen auch Bakterienarten, deren Wachstumsanforderungen unbekannt sind. Frühere Studien deuten darauf hin, dass kulturunabhängige, auf 16S-rRNA-Genen basierende Methoden einen zuverlässigeren und kostengünstigeren Ansatz zur Charakterisierung komplexer mikrobieller Gemeinschaften bieten11. Beispielsweise wurde die Sequenzierung der hypervariablen Regionen des 16S rRNA-Gens erfolgreich eingesetzt, um Bakterien in Weinblättern, Beeren und Wein zu untersuchen 12,13,14. Studien haben gezeigt, dass die Verwendung von 16S rRNA-Metabarcoding oder ganzer metagenomischer Sequenzierung für Mikrobiomstudien geeignet ist15. Es gibt neue Informationen über den möglichen Zusammenhang der bakteriellen Vielfalt mit ihren metabolischen Eigenschaften während der Weinproduktion, die bei der Bestimmung der önologischen Eigenschaften und des Terroirs helfen könnten16.
Die Notwendigkeit, die Vorteile der metagenomischen Werkzeuge durch Next-Generation-Sequencing (NGS) zur Untersuchung der mikrobiellen Ökologie von Trauben und Wein zu maximieren, wurde betont16,17. Auch der Einsatz kulturunabhängiger Methoden auf der Grundlage der Hochdurchsatzsequenzierung zur Profilierung der mikrobiellen Vielfalt des Lebensmittel- und Fermentationsökosystems ist für viele Labore sehr relevant und wertvoll geworden und wird für den industriellen Einsatz empfohlen18,19. Es bietet einen Vorteil bei der Erkennung und taxonomischen Profilierung der vorhandenen mikrobiellen Populationen und des Beitrags von Umweltmikroben, ihrer relativen Häufigkeit und der Alpha- und Beta-Diversität20. Die Sequenzierung der variablen Region der 16S-Region ist zu einem wichtigen Gen der Wahl geworden und wurde in verschiedenen mikrobiellen ökologischen Studien verwendet.
Während sich viele Studien auf Pilze, insbesondere Hefen, während der Weingärung konzentrieren21, berichtete diese Studie über die 16S-Amplikon-Sequenzierung und bioinformatische Werkzeuge, die zur Untersuchung der Bakterien während der Gärung von Traminette-Trauben für die Weinproduktion verwendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI USA</td>
			<td>V3121</td>
			<td>Electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep DNA spinKit for soil&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals, Solon, OH USA</td>
			<td>116560-200</td>
			<td>DNA extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC software</td>
			<td>Babraham Institute, United Kingdom</td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatics&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermaid O</td>
			<td>Scott Laboratory, Petaluma, CA USA&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Fidelity PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>F630S</td>
			<td>Polymerase chain reaction for sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>NEB #E7103</td>
			<td>DNA Library Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit&#160;</td>
			<td>Illumina, San Diego, CA&#160; USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq Control Software (NVCS)</td>
			<td>Illumina, San Diego, CA&#160; USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novaseq6000 platform&#160;</td>
			<td>Illumina, San Diego, CA&#160; USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuiBit</td>
			<td>Thermoscientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quickdrop spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Molecular device, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td>DNA extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimula Sauvignon Blanc</td>
			<td>Scott Laboratory, Petaluma, CA USA&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling the bacterial community of fermenting traminette grapes during wine production using metagenomic amplicon sequencing

Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie und der relativ einfache Zugang zur Verwendung von Bioinformatik-Tools zur Profilierung mikrobieller Gemeinschaftsstrukturen haben ein besseres Verständnis sowohl kultivierbarer als auch nicht kultivierbarer Mikroben in Trauben und Wein ermöglicht. Während der industriellen Fermentation sind bekannte und unbekannte Mikroben oft für die Produktentwicklung und den Fehlgeschmack verantwortlich. Daher kann die Profilierung der Bakterien von der Traube bis zum Wein ein einfaches Verständnis der mikrobiellen Dynamik in situ ermöglichen. In dieser Studie wurden die Bakterien des Gärungsmostes der Traminette-Trauben und der endgültige Wein einer DNA-Extraktion unterzogen, die 15 ng/μl bis 87 ng/μl ergab. Das 16S-Amplikon der hypervariablen Region der V4-Region wurde sequenziert, relativ häufige Bakterien, bestehend aus den Stämmen Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota und gefolgt von der Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota und Acidobacteriota. Eine Venn-Diagramm-Analyse der gemeinsamen einzigartigen operativen taxonomischen Einheiten (OTU) ergab, dass 15 Bakterienstämme sowohl dem Traubenmost, der Gärphase als auch dem endgültigen Wein gemeinsam waren. Phyla, die zuvor nicht berichtet wurden, wurden mit der 16S-Amplikon-Sequenzierung nachgewiesen, ebenso wie Gattungen wie Enterobacteriaceae und Lactobacillaceae. Variationen in der Verwendung organischer Nährstoffe in Wein und ihre Auswirkungen auf Bakterien wurden getestet; Traminette R-Tank mit Fermaid O und Traminette L , stimuliert mit Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. Die Alpha-Diversität mit Hilfe des Kruskal-Wallis-Tests bestimmte den Grad der Gleichmäßigkeit. Die Beta-Diversität deutete auf eine Verschiebung der Bakterien in der Gärungsphase für die beiden Behandlungen hin, und die endgültigen Weinbakterien sahen ähnlich aus. Die Studie bestätigte, dass die 16S-Amplikon-Sequenzierung zur Überwachung von Bakterienveränderungen während der Weinproduktion verwendet werden kann, um die Qualität und bessere Nutzung von Traubenbakterien während der Weinproduktion zu unterstützen.

Die Menge und Qualität der DNA, die aus Traubenmost, gärendem Wein und Endwein extrahiert wurde, wurden zunächst bestimmt; der Mengenwert reicht von 15-87 ng/μL (Tabelle 1).
Sequenzierung und Bioinformatik Der Illumina-Hochdurchsatz-Sequenzer erzeugte eine FASTQ-Datei, die in den Nephele importiert und auf der QIIME 2-Plattform26 angezeigt wurde. Zunächst wurde die FastQC-Software verwendet, um die Sequenzqualit...

Watch this Scientific Journal Video about Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing at JoVE.com

Autor im Rampenlicht: Erforschung des Fermentationsmikrobioms durch Next-Generation-Sequencing

Hier stellen wir ein Protokoll zur Beschreibung der Amplikon-Metagenomik zur Bestimmung der Bakteriengemeinschaft von Traminette-Trauben, gärenden Trauben und Endwein vor.

Profilierung der Bakteriengemeinschaft von gärenden Traminette-Trauben während der Weinproduktion mittels metagenomischer Amplikon-Sequenzierung

Advances in sequencing technology and the relatively easy access to the use of bioinformatics tools to profile microbial community structures have ...

Der Forschungsschwerpunkt liegt auf dem Verständnis des Fermentationsmikrobioms. Dies soll Fragen beantworten, wie z. B. wie vielfältig Mikroben in der natürlichen Fermentation sind und welches Gen, das für Metaboliten kodiert, für Geschmack und Sicherheit notwendig ist. Einer der neuesten Fortschritte auf unserem Gebiet besteht darin, zu verstehen, wie die Dynamik des Mikrobioms mit dem Stoffwechselprofil korreliert, das in fermentierten Lebensmitteln und Getränken beobachtet wird.Die Sequenz der nächsten Generation zeichnet sich als Schlüsseltechnologie aus, die derzeit den Fortschritt in unserem Forschungsbereich vorantreibt

profiling-bacterial-community-fermenting-traminette-grapes-during

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing

655 Aufrufe.  Appalachian State University. Der Forschungsschwerpunkt liegt auf dem Verständnis des Fermentationsmikrobioms. Dies soll Fragen beantworten, wie z. B. wie vielfältig Mikroben in der natürlichen Fermentation sind und welches Gen, das für Metaboliten kodiert, für Geschmack und Sicherheit notwendig ist. Einer der neuesten Fortschritte auf unserem Gebiet besteht darin, zu verstehen, wie die Dynamik des Mikrobioms mit dem Stoffwechselprofil korreliert, das in fermentierten Lebensmitteln und Getränken beobachtet wird....

Serie: Autor im Rampenlicht: Erforschung des Fermentationsmikrobioms durch Next-Generation-Sequencing

Investigating the Microbial Community in the Termite Hindgut - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes. The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaft in der Termite Enddarm - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The ...

Forschung

Biologie

Layers of Symbiosis - Visualizing the Termite Hindgut Microbial Community

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth.  Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth. Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Schichten von Symbiosis - Visualisierung der Termite Enddarm mikrobiellen Gemeinschaft

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

Tick Microbiome Charakterisierung von Next-Generation-16 s rRNA Amplikons Sequenzierung

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive organs/gametes. Recent advances in CRISPR-Cas9 genome editing technology allow for high editing efficacy and timesaving knockout mutations of endogenous candidate genes at specific sites. Additionally, Agrobacterium-mediated genetic transformation of rice is also a key method for gene modification, which has been widely adopted by many public and private laboratories. In this study, we applied CRISPR-Cas9 genome editing tools and successfully generated three male sterile mutant lines by targeted genome editing of OsABCG15 in a japonica cultivar. We used a modified Agrobacterium-mediated rice transformation method that could provide excellent means of genetic emasculation for hybrid seed production in rice. Transgenic plants can be obtained within 2&#8211;3 months and homozygous transformants were screened by genotyping using PCR amplification and Sanger sequencing. Basic phenotypic characterization of the male sterile homozygous line was performed by microscopic observation of the rice male reproductive organs, pollen viability analysis by iodine potassium iodide (I2-KI) staining semi-thin cross-sectioning of developing anthers.

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

This work describes the use of CRISPR-Cas9 genome editing technology to knockout endogenous gene OsABCG15 followed by a modified Agrobacterium-mediated transformation protocol to produce a stable male-sterile line in rice.

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Probenvorbereitung für metabolisches Profiling mittels MALDI-Massenspektrometrie-Bildgebung

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their recruited proteins, lead to temporal and spatial control of gene expression. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&#38;Tag) is an enzyme-tethering method in which the specific chromatin protein is firstly recognized by its specific antibody, and then the antibody tethers a protein A-transposase (pA-Tn5) fusion protein, which cleaves the targeted chromatin in situ by the activation of magnesium ions. Here, we provide our previously published CUT&#38;Tag protocol using intact nuclei isolated from allortetraploid cotton leaves with modification. This step-by-step protocol can be used for epigenomic research in plants. In addition, substantial modifications for plant nuclei isolation are provided with critical comments.

Cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag) is an efficient chromatin epigenomic profiling strategy. This protocol presents a refined CUT&amp;Tag strategy for the profiling of histone modifications in plants.

Profilierung der H3K4me3-Modifikation in Pflanzen mittels Spaltung unter Targets und Tagmentation

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

Methods Article

Profilierung der Bakteriengemeinschaft von gärenden Traminette-Trauben während der Weinproduktion mittels metagenomischer Amplikon-Sequenzierung