Si ringraziano i finanziamenti dell'Appalachian State University Research Council (URC) e della borsa di studio CAPES Print Travel che hanno sostenuto la visita della FAO all'Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto - São Paulo, Brasile. Questo studio è stato finanziato in parte dal Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Codice Finanziario 001. ECPDM è grata per la sovvenzione CAPES Print Travel che ha sostenuto la sua visita all'Appalachian State University. ECPDM è assegnista di ricerca 2 presso il Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasile (CNPq).

1. Produzione sperimentale di vino
<ol><li>Ottenere l'uva Traminnette dal vino Dynamis Estate a Jonesville, nel vigneto della Carolina del Nord, diraspare e pigiare per rilasciare il mosto in due fermentatori separati a cielo aperto da 600 L e lasciare sulle bucce per circa 4 giorni con i coperchi.</li>
	<li>Punzonare i tappi una volta al giorno per mantenere la pelle bagnata e limitare la produzione di acidi volatili (VA). NOTA: L'idea è che molti dei precursori aromatici (monoterpeni) si trovino nelle bucce e lascino il succo a contatto con la buccia per aumentare il potenziale aromatico del vino.</li>
	<li>Dopo 4 giorni, pecare Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Questo lievito è stato selezionato in quanto è un forte fermentatore ed è associato all'esaltazione del carattere varietale del vino delle uve.</li>
	<li>In un serbatoio, Traminette R, aggiungere 20 g/hL di Fermaid O quando il grado brix è a 17,7 e 20 g/hL di Fermaid O e 12,5 g/hL di Fermaid K a 13,1 g/hL per ottenere la sicurezza della fermentazione, mentre nell'altro serbatoio Traminette L, aggiungere 40 g/hL di Stimula Sauvignon blanc quando il grado brix è a 17,1. Aggiungere anche 20 g/hL di Fermaid O quando il grado brix è a 13,4 per esaltare il carattere varietale del vino.</li>
	<li>Prelevare campioni in doppio di mosto (giorno 1), lievito aggiunto (giorno 4), mosto fermentato (giorno 15) e campioni di vino finito (giorno 30) e conservare a -20 °C prima dell'estrazione del DNA e dell'analisi metagenomica.</li>
</ol>2. Estrazione del DNA per la metagenomica
<ol><li>Conservare tutti i campioni duplicati ottenuti sopra su ghiaccio fino alla prima centrifugazione.</li>
	<li>Trasferire 20 mL del campione fermentato in una provetta sterile con tappo a vite da 50 mL.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di acqua fredda e omogeneizzare (vortex). Centrifugare per 1 minuto a 800 x g a 4 °C e trasferire il surnatante in una nuova provetta da 50 mL. NOTA: Questo passaggio rimuoverà i solidi del campione.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.3 due volte e raggruppare i surnatanti nella stessa provetta.</li>
	<li>Centrifugare il surnatante a 3.000 x g a 4 °C per 20 minuti per pellettare le cellule. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 1 mL di PBS, trasferire in una provetta con tappo a vite da 2 mL e centrifugare a 14.000 x g per 2 min. Eseguire altri due lavaggi utilizzando PBS.</li>
	<li>A questo punto, congelare i pellet a -20°C o seguire il passaggio 2.8. È importante che tutti i campioni siano trattati allo stesso modo.</li>
	<li>Aggiungere 978 μL di tampone fosfato di sodio. Preparare il tampone fosfato di sodio, aggiungere 3,1 g di NaH2PO4· H2O e 10,9 g di Na2HPO4 (anidro) a H2O distillato per ottenere un volume di 1 L e regolare il pH a 7,4.</li>
	<li>Aggiungere 122 μL di tampone di DNA (DNA spin kit) e vortice.</li>
	<li>Lasciare riposare in frigorifero (4 °C) per 45 min-1 h. Vortex i campioni ogni 15 min. Questo passaggio può essere lasciato durante la notte (o/n) o fino a quando non si è pronti per continuare a utilizzare il kit di rotazione del DNA.</li>
	<li>Trasferire 1 mL di campione in una provetta della soluzione di lisi 1 (kit di centrifugazione del DNA) e serrare il tappo (scrivere il numero del campione sul lato della provetta e non sul tappo; i reagenti del kit rimuoveranno tutto ciò che è scritto sul tappo).</li>
	<li>Omogeneizzare il campione in un macinatore per sbattere le perle (6,5 m/s, CY: 24 x 2) per 60 s per tre volte. Se il macinino battitallone ha il dispositivo per mettere il ghiaccio, metti 50 g di ghiaccio secco sotto i tubi. In caso contrario, conservare i campioni su ghiaccio umido per 5 minuti tra una fase di omogeneizzazione e l'altra.</li>
	<li>Centrifugare le provette E della matrice lisante (kit di centrifugazione del DNA) per 1 minuto a 16800 x g (o velocità massima).</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una microprovetta pulita. Successivamente, aggiungere 250 μL di reagente per la soluzione di precipitazione proteica (PPS) (kit di centrifugazione del DNA) e mescolare agitando la provetta a mano 10 volte.</li>
	<li>Centrifugare per 5 minuti a 16800 x g per pellettare il precipitato.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una provetta sterile da 15 ml. Aggiungere 1 mL di sospensione della matrice di legame (kit di spin del DNA) al surnatante. NOTA: Risospendere la sospensione della matrice di legame prima dell'uso fino a quando non è omogenea.</li>
	<li>Capovolgere le provette a mano per 2 minuti, quindi lasciare riposare le provette in una griglia per 3 minuti (per consentire la sedimentazione della matrice di silice).</li>
	<li>Rimuovere con cautela 1 mL di surnatante. Risospendere la matrice nel surnatante rimanente.</li>
	<li>Trasferire 600 μL della miscela in una provetta con filtro centrifugo (DNA spin kit) e centrifugare per 1 minuto a 14500 x g.</li>
	<li>Aggiungere il restante composto e centrifugare.</li>
	<li>Decantare a flusso continuo e aggiungere 500 μL di soluzione di lavaggio (kit di centrifugazione del DNA) nella provetta del filtro centrifugante e centrifugare per 1 minuto a 14500 x g (assicurarsi di aggiungere EtOH alla soluzione di lavaggio; vedere il manuale del prodotto). Decantare il flow-through e ripetere il lavaggio altre due volte (3 lavaggi in totale).</li>
	<li>Decantare il flow-through e centrifugare per altri 2 minuti a 14.500 x g per asciugare la matrice di soluzione di lavaggio residua.</li>
	<li>Rimuovere il filtro rotante e metterlo in una nuova provetta di raccolta (kit di centrifuga DNA). Asciugare all'aria il filtro centrifugo per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Riscaldare l'acqua priva di DNAsi (DNA spin kit) a 55 °C per 5 min. Aggiungere 50 μL di acqua priva di DNAsi e mescolare delicatamente la matrice sulla membrana filtrante con un puntale per pipetta per un'efficiente eluizione del DNA. Lasciare riposare i campioni a RT per 1 minuto, quindi centrifugare per 1 minuto a 14500 x g per eluire il DNA.</li>
	<li>Mettere i campioni sul ghiaccio. Caricare la miscela del campione (2 μL di campione + 2 μL di acqua + 1 μL di tampone di carico) in un gel. Misurare la concentrazione di DNA.</li>
	<li>Conservare i campioni a -20 °C.</li>
	<li>Utilizzare uno spettrofotometro per quantificare il DNA estratto. NOTA: Un volume di 1 μL di DNA è stato eliminato e quantificato e la qualità del DNA è stata notata con un rapporto A260/A280.</li>
</ol>3. Elettroforesi del DNA
<ol><li>Preparare un gel di agarosio all'1% in un tampone da 0,5 Tris/Borato/EDTA (TBE) (20 mL per un mini gel, 70-100 mL per un gel medio). Pesare l'agarosio+tampone, far bollire in microonde per sciogliere l'agarosio, ripesare e aggiungere dH2O al peso originale. Raffreddare la soluzione di agarosio a 55-60 °C e versarla nella formatrice di gel con pettine. Lasciare solidificare il gel.</li>
	<li>Aggiungere 1 μL di tampone di caricamento gel 10x al campione (10 μL) e caricarlo sul gel accanto a un marcatore di peso molecolare. Passare dal negativo (nero) al positivo (rosso) a 100-115 V (gel grande) o 90 V (mini gel) fino a quando il colorante blu non è vicino al fondo.</li>
	<li>Colorare il gel per 30 minuti in bromuro di etidio da 1 μL/mL o verde SYBR (sono necessari guanti e occhiali in nitrile), risciacquare in acqua e guardare sotto una fonte di luce ultravioletta (UV). Dai campioni duplicati, selezionare la resa più alta per l'ulteriore elaborazione.</li>
</ol>4. Sequenziamento ad alto rendimento
<ol><li>Amplificare la regione ipervariabile V4 del gene rRNA 16S utilizzando primer specifici 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') e 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. Impostare le condizioni di reazione a catena della polimerasi (PCR) a 94 °C per 2 min, 30 cicli di 94 °C per 20 s, 58 °C per 20 s, 65 °C per 1 min e 65 °C per 10 min (estensione finale).</li>
	<li>Eseguire reazioni PCR con una miscela master PCR ad alta fedeltà (Table of Materials).</li>
	<li>Genera librerie con il kit di preparazione della libreria di DNA e quindi sequenzia utilizzando il sequenziamento a due estremità su una piattaforma di sequenziamento. NOTA: In questo caso, le librerie generate con il kit di preparazione della libreria del DNA NEBNext Ultra II sono state sequenziate utilizzando il sequenziamento Illumina paired-end (2 × 250 bp) sulla piattaforma novaseq6000.</li>
	<li>Seguire i passaggi di sequenziamento:<ol><li>Fase 1: Tagliare il DNA con un enzima, di solito con un metodo che seleziona per una dimensione generale.<ol><li>Aggiungere 3,5 μL di tampone di sequenziamento e 1,5 μL di miscela enzimatica a 25 μL di DNA (circa 1 μg), mescolare 10 volte con una pipetta e centrifugare rapidamente.</li>
			<li>Mettere in un termociclatore con le seguenti condizioni: preriscaldare il coperchio a 75°C, (1) 30 min per 20 °C (2) 30 min per 65 °C (3) tenere a 4°C.</li>
		</ol></li>
		<li>Passaggio 2: aggiungere gli adattatori tramite legatura<ol><li>Aggiungere 15 μL di miscela master di legatura, 1,25 μL di adattatore, 0,5 μL di potenziatore di legatura e 30 μL di miscela di DNA di preparazione finale con una pipetta.</li>
			<li>Incubare a 20 °C per 15 minuti in un termociclatore e quindi aggiungere 1,5 μL di enzima reagente di escissione uracil-specifico (USER) alla miscela di legatura per ottenere un totale di 48,26 μL. Incubare a 37 °C per 15 minuti.</li>
			<li>Aggiungere 43,5 μL di microsfere magnetiche al DNA di legatura dell'adattatore, mescolare 20 volte con una pipetta e incubare per 5 minuti a RT. Separare le perle con un rack magnetico, quindi incubare per 5-10 minuti e scartare il surnatante.</li>
			<li>Lavare il pellet con 100 μL di etanolo all'80%, asciugare per 30 secondi e lavare di nuovo. Eluire le perle e il pellet in 8,5 μL di Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC H20 a 10 mM, miscelare con una pipetta e incubare a RT per 2 min.</li>
			<li>Incubare nel rack magnetico e rimuovere 7,5 μL di DNA eluito come surnatante. Posizionare l'eluito in una nuova provetta ed eseguire una fase di PCR.</li>
			<li>Innanzitutto, aggiungere 12,5 μL di master mix, 2,5 μL di primer indice i7 e 2,5 μL di primer PCR universale/primer i5 al DNA legato-adattatore da 7,5 μL per ottenere 25 μL di miscela di reazione PCR. Utilizzare la seguente condizione PCR: preriscaldare il coperchio a 103 °C. 98 °C per 30 s, 98 °C per 10 s, 65 °C per 75 s, 65 °C per 5 min e mantenere a 4 °C dopo 10 cicli.</li>
			<li>Pulire il DNA amplificato da 25 μL. Aggiungere 22,5 μL di microsfere magnetiche e mescolare 20 volte. Incubare a RT per 5 minuti e rimuovere 50 μL del surnatante. Lavare le perline con 100 μL di etanolo all'80% e rimuovere tutto l'etanolo asciugando delicatamente le perle per 30 secondi.</li>
			<li>Risospendere le perle marrone scuro in 16 μL di acqua, mescolare 20 volte con una pipetta e posizionare nel rack magnetico per 30-60 s. Trasferire 15 μL in una nuova provetta.</li>
			<li>Determinare la concentrazione di DNA utilizzando un fluorimetro. Mescolare 90 μL di tampone + 1 μL di colorante + 2 μL di campione di DNA e leggere la concentrazione. Diluire il DNA a 2 nM, caricare 27-30 μL sulla cella di flusso e posizionarlo nel sequenziatore.</li>
		</ol></li>
		<li>Fase 3: Sequenziare gli adattatori, ibridare le librerie generate sopra alla matrice della cella di flusso modellata e catturare il DNA secondo le istruzioni del produttore. Usalo come modello per la seconda sintesi.<ol><li>Quindi, amplificare il secondo filamento in un cluster clonale. Linearizzare il cluster e bloccare i siti attivi. Aggiungere il primer di sequenziamento per fornire un sito per il sequenziamento per sintesi nella sequenza secondo il protocollo del produttore. NOTA: Chimicamente, i nucleotidi modificati si legano al filamento stampo di DNA utilizzando la complementarità naturale. Ogni nucleotide ha un tag fluorescente e un terminatore reversibile che blocca l'inclusione della base successiva. Pertanto, la presenza di un segnale fluorescente indica quale nucleotide è inserito e il terminatore viene scisso per consentire alla base successiva di legarsi.</li>
		</ol></li>
		<li>Passo 4: Amplificare il filamento a legame singolo per ottenere cluster di sequenze che vengono sequenziate in tandem per sintesi. NOTA: I cluster forniscono un segnale più luminoso rispetto a un singolo filamento attraverso la scansione bidirezionale e la chimica di sequenziamento a due canali. Il software di sequenziamento trasferisce automaticamente i file delle chiamate di base (*.cbcl) alla posizione della cartella di output specificata per l'analisi dei dati.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Bioinformatica
<ol><li>Generare i dati della sequenza come file FASTQ. Analizza per includere le seguenti parti.<ol><li>Parte I:<ol><li>Salvate i file FASTQ ottenuti dal sequencer, fate clic per aprire un foglio di calcolo e create i file di mappatura/metadati.</li>
			<li>Aprire il sito Web di Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), caricare i file FASTQ, leggere QC, filtraggio e ritaglio in QIIME222. Depositare le sequenze grezze come archivio di lettura delle sequenze (SRA) e GenBank in NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)</li>
		</ol></li>
		<li>Parte II: Andate sul sito web di Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), eseguite le letture demultiplexate paired-end, la sostituzione dei filtri e gli errori chimera, e unite usando DADA223. Utilizzare il classificatore Naive Bayes addestrato sul database OTU 99% Silva versione 132 per eseguire l'assegnazione tassonomica batterica al 97% di somiglianza24.</li>
		<li>Parte III: Apri il sito Web di MicrobiomeDB, fai clic per caricare i file e genera le curve di alfa-diversità, beta-diversità, abbondanza relativa e rarefazione OTU (https://microbiomedb.org/mbio/app).</li>
		<li>Parte IV: Aprire un foglio di calcolo e trasferire i dati per creare mappe di calore, diagrammi di Venn e dimensioni dell'effetto dell'analisi discriminante lineare (https://microbiomedb.org/mbio/app).</li>
	</ol></li>
</ol>6. Analisi statistica
<ol><li>Aprire QIIME222 e determinare le differenze significative nella diversità alfa tra i gruppi utilizzando lo script alpha-group-meaning. Questo eseguirà anche il test di Kruskal-Wallis.</li>
	<li>Determinare le differenze nella diversità beta tra i gruppi utilizzando PERMANOVA, incluso un test a coppie25.</li>
	<li>Ottenere le differenze significative nella struttura della comunità batterica tra i gruppi utilizzando MicrobiomeDB. Un valore p ≤0,05 è stato considerato statisticamente significativo.</li>
</ol>

Profilazione della comunità batterica nell'uva utilizzando la metagenomica dell'amplicone

<ol>
	<li>Skinkis, P. A., Bordelon, B. P., Wood, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+monoterpene+constituents+in+traminette,+gew&#252;rztraminer,+and+riesling+winegrapes.">Comparison of monoterpene constituents in traminette, gew&#252;rztraminer, and riesling winegrapes.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 59, 440-445 (2008).</li><li>Bordelon, B. P., Skinkis, P. A., Howard, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+training+system+on+vine+performance+and+fruit+composition+of+Traminette.">Impact of training system on vine performance and fruit composition of Traminette.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 59, 39-46 (2008).</li><li>Reisch, B. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+non-parametric+multivariate+analysis+of+variance.">A new method for non-parametric multivariate analysis of variance.</a> Austral Ecology. 26 (1), 32-46 (2001).</li><li>Bolyen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interactive,+scalable+and+extensible+microbiome+data+science+using+QIIME+2.">interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2.</a> Nature Biotechnology. 37, 852-857 (2019).</li><li>Fadiji, A. E., Babalola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics+methods+for+the+study+of+plant-associated+microbial+communities:+A+review.">Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: A review.</a> Journal of Microbiological Methods. 170, 105860 (2020).</li><li>van Hijum, S. A., Vaughan, E. E., Vogel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+state-of-art+sequencing+technologies+to+indigenous+food+fermentations.">Application of state-of-art sequencing technologies to indigenous food fermentations.</a> Current Opinion in Biotechnology. 24, 178-186 (2013).</li><li>V&#237;quez-R, L., Fleischer, R., Wilhelm, K., Tschapka, M., Sommer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumping+the+green+wall:+The+use+of+PNA-DNA+clamps+to+enhance+microbiome+sampling+depth+in+wildlife+microbiome+research.">Jumping the green wall: The use of PNA-DNA clamps to enhance microbiome sampling depth in wildlife microbiome research.</a> Ecology and Evolution. 10 (20), 11779-11786 (2020).</li><li>Bukin, Y. S., Galachyants, P., Yu, I. V., Morozov, S. V., Bukin, A. S., Zakharenko, T. I., Zemskaya, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results.">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6, 190007 (2019).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Il protocollo di metagenomica parte dal campionamento del mosto d'uva, e quando al mosto è stato aggiunto il lievito, il vino in fermentazione e i campioni finali di vino. Questo è stato seguito dall'estrazione del DNA duplicato che è stato estratto con successo da questi campioni. Le quantità ottenute variavano in concentrazione da 15 ng/μL a 87 ng/μL. Ciò dimostra che il protocollo di estrazione del DNA è efficace per gli studi metagenomici del vino. Sebbene la qualità del DNA in A260/A280 vari, ciò può esse...

L'uva Traminette è caratterizzata da una produzione di vino di qualità superiore, oltre che da una resa apprezzabile e da una parziale resistenza a diverse infezioni fungine 1,2,3. La fermentazione naturale dell'uva si basa sui microrganismi associati, sull'ambiente di produzione del vino e sui recipienti di fermentazione 4,5. Spesso, molte aziende vinicole si affidano a lieviti e batteri selvatici per la fermentazione, la produzione di alcol, esteri, aroma e sviluppo del sapore6.
L'obiettivo di questo studio è quello di esaminare la composizione batterica dell'uva e monitorarne la dinamica durante la fermentazione. Tuttavia, l'uso moderno di colture starter come il Saccharomyces cerevisiae per la fermentazione primaria, dove viene prodotto l'alcol, è comune a diversi stili di vino7. Inoltre, la fermentazione secondaria, in cui l'acido malico viene decarbossilato da Oenococcus oeni ad acido lattico, migliora il profilo organolettico e gustativo del vino e riduce l'acidità del vino 8,9. Con i recenti progressi nell'uso di metodi indipendenti dalla coltura, è ora possibile determinare diversi microbi associati all'uva da vino e alle specie che vengono trasferite al mosto e partecipano alla fermentazione in tempi diversi fino al prodotto finale10.
I ruoli e le dinamiche dei batteri selvatici provenienti da diverse uve trasferite al mosto durante la fermentazione del vino sono poco conosciuti. La tassonomia di molti di questi batteri non è nemmeno nota, o le loro proprietà fenotipiche non sono caratterizzate. Questo rende la loro applicazione nella fermentazione in cocoltura ancora poco sottoutilizzata. Tuttavia, l'analisi microbiologica basata sulla coltura è stata utilizzata per determinare la popolazione batterica associata all'uva e al vino10. È ampiamente noto che la placcatura selettiva della coltura è noiosa, soggetta a contaminazione, ha una bassa riproducibilità e la produzione può essere dubbia; Mancano anche le specie batteriche le cui esigenze di crescita sono sconosciute. Studi precedenti indicano che le metodologie basate sul gene rRNA 16S, indipendenti dalla coltura, offrono un approccio più affidabile ed economico alla caratterizzazione di comunità microbiche complesse11. Ad esempio, il sequenziamento delle regioni ipervariabili del gene rRNA 16S è stato impiegato con successo per studiare i batteri nelle foglie d'uva, nelle bacche e nel vino 12,13,14. Gli studi hanno dimostrato che l'uso del metabarcoding dell'rRNA 16S o del sequenziamento metagenomico dell'intero è adatto per gli studi sul microbioma15. Stanno emergendo informazioni sul possibile legame tra la diversità batterica e le loro caratteristiche metaboliche durante la produzione del vino, che potrebbero aiutare nella determinazione delle proprietà enologiche e del terroir16.
È stata sottolineata la necessità di massimizzare i vantaggi degli strumenti metagenomici che utilizzano il sequenziamento di nuova generazione (NGS) per studiare l'ecologia microbica dell'uva e del vino16,17. Inoltre, l'uso di metodi indipendenti dalla coltura basati sul sequenziamento ad alto rendimento per profilare la diversità microbica dell'ecosistema alimentare e di fermentazione è diventato molto rilevante e prezioso per molti laboratori ed è raccomandato per l'uso industriale18,19. Fornisce un vantaggio per il rilevamento e la profilazione tassonomica delle attuali popolazioni microbiche e del contributo dei microbi ambientali, della loro abbondanza relativa e della diversità alfa e beta20. Il sequenziamento della regione variabile della regione 16S è diventato un importante gene di scelta ed è stato utilizzato durante diversi studi di ecologia microbica.
Mentre molti studi si concentrano sui funghi, in particolare sui lieviti, durante la fermentazione del vino21, questo studio ha riportato il sequenziamento dell'amplicone 16S e gli strumenti bioinformatici utilizzati per studiare i batteri durante la fermentazione dell'uva Traminette per la produzione di vino.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI USA</td>
			<td>V3121</td>
			<td>Electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep DNA spinKit for soil&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals, Solon, OH USA</td>
			<td>116560-200</td>
			<td>DNA extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC software</td>
			<td>Babraham Institute, United Kingdom</td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatics&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermaid O</td>
			<td>Scott Laboratory, Petaluma, CA USA&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Fidelity PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>F630S</td>
			<td>Polymerase chain reaction for sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>NEB #E7103</td>
			<td>DNA Library Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit&#160;</td>
			<td>Illumina, San Diego, CA&#160; USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq Control Software (NVCS)</td>
			<td>Illumina, San Diego, CA&#160; USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novaseq6000 platform&#160;</td>
			<td>Illumina, San Diego, CA&#160; USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuiBit</td>
			<td>Thermoscientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quickdrop spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Molecular device, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td>DNA extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimula Sauvignon Blanc</td>
			<td>Scott Laboratory, Petaluma, CA USA&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling the bacterial community of fermenting traminette grapes during wine production using metagenomic amplicon sequencing

I progressi nella tecnologia di sequenziamento e l'accesso relativamente facile all'uso di strumenti bioinformatici per profilare le strutture delle comunità microbiche hanno facilitato una migliore comprensione dei microbi coltivabili e non coltivabili nell'uva e nel vino. Durante la fermentazione industriale, i microbi, noti e sconosciuti, sono spesso responsabili dello sviluppo del prodotto e del sapore sgradevole. Pertanto, la profilazione dei batteri dall'uva al vino può consentire una facile comprensione delle dinamiche microbiche in situ . In questo studio, i batteri del mosto d'uva Traminette in fase di fermentazione e il vino finale sono stati sottoposti a estrazione di DNA che ha prodotto da 15 ng/μL a 87 ng/μL. È stato sequenziato l'amplicone 16S della regione ipervariabile della regione V4, batteri relativamente abbondanti costituiti da phyla Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota e seguiti da Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota e Acidobacteriota. Un'analisi del diagramma di Venn delle unità tassonomiche operative uniche condivise (OTU) ha rivelato che 15 phyla batterici erano comuni sia al mosto d'uva, alla fase di fermentazione che al vino finale. I phyla che non erano stati segnalati in precedenza sono stati rilevati utilizzando il sequenziamento dell'amplicone 16S, così come generi come Enterobacteriaceae e Lactobacillaceae. È stata testata la variazione nell'uso di nutrienti organici nel vino e il suo impatto sui batteri; Serbatoio di Traminette R contenente Fermaid O e Traminette L stimolati con Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. La diversità alfa utilizzando il test di Kruskal-Wallis ha determinato il grado di uniformità. La diversità beta indicava un cambiamento nei batteri nella fase di fermentazione per i due trattamenti, e i batteri finali del vino sembravano simili. Lo studio ha confermato che il sequenziamento dell'amplicone 16S può essere utilizzato per monitorare i cambiamenti batterici durante la produzione del vino per supportare la qualità e un migliore utilizzo dei batteri dell'uva durante la produzione del vino.

Per prima cosa sono state determinate la quantità e la qualità del DNA estratto dal mosto d'uva, dal vino in fermentazione e dal vino finale; il valore della quantità varia da 15 a 87 ng/μL (Tabella 1).
Sequenziamento e bioinformatica Il sequencer ad alta produttività Illumina ha generato un file FASTQ che è stato importato in Nephele e visualizzato sulla piattaforma QIIME2 26. In primo luogo, è stato utilizza...

Watch this Scientific Journal Video about Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing at JoVE.com

Autore in primo piano: Esplorare il microbioma di fermentazione attraverso il sequenziamento di nuova generazione

Qui, presentiamo un protocollo per descrivere la metagenomica degli ampliconi per determinare la comunità batterica dell'uva Traminette, dell'uva in fermentazione e del vino finale.

Profilazione della comunità batterica dell'uva traminette in fermentazione durante la produzione del vino utilizzando il sequenziamento metagenomico degli ampliconi

Advances in sequencing technology and the relatively easy access to the use of bioinformatics tools to profile microbial community structures have ...

L'ambito della ricerca si concentra sulla comprensione del microbioma fermentativo. Questo per rispondere a domande come quanto sono diversi i microbi nella fermentazione naturale e quale gene che codifica per il metabolita è necessario per il sapore e la sicurezza. Uno degli ultimi progressi nel nostro campo riguarda la comprensione di come le dinamiche del microbioma siano correlate al profilo metabolico osservato negli alimenti e nelle bevande fermentate.La sequenza di nuova generazione si distingue come una tecnologia fondamentale che sta attualmente guidando i progressi nel nostro campo di ricerca

profiling-bacterial-community-fermenting-traminette-grapes-during

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing

655 Views.  Appalachian State University. L'ambito della ricerca si concentra sulla comprensione del microbioma fermentativo. Questo per rispondere a domande come quanto sono diversi i microbi nella fermentazione naturale e quale gene che codifica per il metabolita è necessario per il sapore e la sicurezza. Uno degli ultimi progressi nel nostro campo riguarda la comprensione di come le dinamiche del microbioma siano correlate al profilo metabolico osservato negli alimenti e nelle bevande fermentate.La sequenza di nuova genera...

Video: Autore in primo piano: Esplorare il microbioma di fermentazione attraverso il sequenziamento di nuova generazione

Investigating the Microbial Community in the Termite Hindgut - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

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Indagare la comunità microbica nel hindgut Termite - Intervista

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Biologia

Layers of Symbiosis - Visualizing the Termite Hindgut Microbial Community

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth.  Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

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Livelli di simbiosi - Visualizzazione della Comunità hindgut Termite microbica

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Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Utilizzo di RNA-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione Dimensione del corpo nel nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Analisi della traduzione innesco durante condizioni di stress da polisoma Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

Tick Microbiome caratterizzazione ordinando Amplicon del rRNA 16S di prossima generazione

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive organs/gametes. Recent advances in CRISPR-Cas9 genome editing technology allow for high editing efficacy and timesaving knockout mutations of endogenous candidate genes at specific sites. Additionally, Agrobacterium-mediated genetic transformation of rice is also a key method for gene modification, which has been widely adopted by many public and private laboratories. In this study, we applied CRISPR-Cas9 genome editing tools and successfully generated three male sterile mutant lines by targeted genome editing of OsABCG15 in a japonica cultivar. We used a modified Agrobacterium-mediated rice transformation method that could provide excellent means of genetic emasculation for hybrid seed production in rice. Transgenic plants can be obtained within 2&#8211;3 months and homozygous transformants were screened by genotyping using PCR amplification and Sanger sequencing. Basic phenotypic characterization of the male sterile homozygous line was performed by microscopic observation of the rice male reproductive organs, pollen viability analysis by iodine potassium iodide (I2-KI) staining semi-thin cross-sectioning of developing anthers.

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

This work describes the use of CRISPR-Cas9 genome editing technology to knockout endogenous gene OsABCG15 followed by a modified Agrobacterium-mediated transformation protocol to produce a stable male-sterile line in rice.

Agrobacterium-Mediato Trasformazione Genetica, Produzione Transgenica, e la sua applicazione per lo studio dello sviluppo riproduttivo maschile nel riso

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Preparazione del campione per la profilazione metabolica utilizzando la spettrometria di massa MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their recruited proteins, lead to temporal and spatial control of gene expression. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&#38;Tag) is an enzyme-tethering method in which the specific chromatin protein is firstly recognized by its specific antibody, and then the antibody tethers a protein A-transposase (pA-Tn5) fusion protein, which cleaves the targeted chromatin in situ by the activation of magnesium ions. Here, we provide our previously published CUT&#38;Tag protocol using intact nuclei isolated from allortetraploid cotton leaves with modification. This step-by-step protocol can be used for epigenomic research in plants. In addition, substantial modifications for plant nuclei isolation are provided with critical comments.

Cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag) is an efficient chromatin epigenomic profiling strategy. This protocol presents a refined CUT&amp;Tag strategy for the profiling of histone modifications in plants.

Profilazione della modifica H3K4me3 negli impianti utilizzando la scissione sotto target e tagmentazione

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

Methods Article

Profilazione della comunità batterica dell'uva traminette in fermentazione durante la produzione del vino utilizzando il sequenziamento metagenomico degli ampliconi