Este trabalho foi apoiado pela Comissão de Saúde da Província de Sichuan (120025).

As células MCF-7 utilizadas no presente estudo foram obtidas de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Cultura celular
<ol><li>Cultivar as células MCF-7 em atmosfera umidificada de 5% de CO2 a 37 °C com DMEM contendo FBS a 10% e penicilina a 1% (10.000 U/mL)/estreptomicina (10.000 μg/mL) (ver Tabela de Materiais). NOTA: As células que cobrem 90% do fundo da placa foram empregadas para o experimento e divididas nos seguintes grupos: grupo controle, grupo cloridrato de doxorrubicina (DXR, 5 μM) e grupo Sal (20 μM, 40 μM e 80 μM), ou grupo controle, grupo LY294002 (10 μM, um inibidor da PI3K), grupo Sal (80 μM) e grupo LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (ver Tabela de Materiais).</li>
</ol>2. Ensaio de viabilidade celular
NOTA: Para obter detalhes sobre este procedimento, consulte um relatório anterior27.
<ol><li>Semear células MCF-7 com densidade de 8 x 104 células/poço em placas de 96 poços e incubar com Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM e 320 μM) por 24 h ou Sal (20, 40, 80 μM) por 12 h/24 h/36 h/48 h durante a noite até que as células estejam aderentes.</li>
	<li>Após o tratamento, co-incubar as células MCF-7 com 10 μL/poço de solução de CCK-8 (ver Tabela de Materiais) por 2 h. Em seguida, meça a densidade óptica a 450 nm (OD450) com um leitor automático de microplacas.</li>
</ol>3. Migração e invasão celular
NOTA: Para obter detalhes sobre este procedimento, consulte um relatório anterior35.
<ol><li>Incubar 2 mL de células de 5 x 10 6 células/mL semeadas em placas de6 poços para cobrir 90% do fundo da placa.</li>
	<li>Execute uma ferida de arranhão linear ao longo do centro da monocamada celular com uma ponta de pipeta estéril. Adquirir imagens em microscópio óptico às 0 h, 24 h e 48 h.</li>
	<li>Use o software Image J para medir a largura das feridas de arranhões.</li>
	<li>Para o ensaio de transwell, suspender as células MCF-7 sem meio de soro e semear na câmara de transwell superior pré-revestida com ou sem Matrigel (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>No fundo da câmara de transwell, use meio completo DMEM como indutor químico. Após 24 h, remover as células da câmara superior e fixar as células invasoras e migrantes remanescentes em metanol35.</li>
	<li>Manchar as células MCF-7 com solução de cristal violeta (ver Tabela de Materiais). Capture as imagens usando um microscópio óptico.</li>
</ol>4. Avaliação da atividade da Na+-K+-ATPase e Ca 2+-Mg2+-ATPase
<ol><li>Use um kit de ácido bicinconínico (BCA) para medir a concentração de proteína em células MCF-7 lisadas, seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).<ol><li>Adicione amostras das células lisadas em seus grupos correspondentes nas placas de 96 poços. Depois disso, adicione a solução de trabalho para incubar ainda mais a 37 °C durante 5 min. Finalmente, meça os valores de OD636 com um leitor de microplacas multifuncional.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Análise por citometria de fluxo da apoptose e do ciclo celular
NOTA: Para obter detalhes sobre este procedimento, consulte um relatório anterior31.
<ol><li>Digerir as células e colher para ressuspender em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por uma coloração de 20 minutos com anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI) (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, determinar o número de células apoptóticas usando um citômetro de fluxo.</li>
	<li>Misturar a solução da amostra ressuspensa com a solução de PI durante uma incubação de 30 minutos, seguida da detecção com um citómetro de fluxo.</li>
</ol>6. Coloração por fluorescência DCFH-DA e Fluo-4 AM
NOTA: Para obter detalhes sobre este procedimento, consulte um relatório anterior29.
<ol><li>Incubar as células MCF-7 durante 20 minutos com uma sonda de fluorescência de 10 μM DCFH-DA (ver Tabela de Materiais) a 37 °C. Depois de remover completamente o excesso de DCFH-DA lavando três vezes com PBS, teste a intensidade da fluorescência nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 488 nm e 525 nm, respectivamente, usando um microscópio de fluorescência.</li>
	<li>Incubar as células MCF-7 com uma solução de sonda fluorescente Fluo-4 AM de 5 μM (ver Tabela de Materiais) durante 45 minutos a 37 °C. Após a lavagem com PBS três vezes, determinar os valores de intensidade de fluorescência nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 488 nm e 516 nm, respectivamente, usando um microscópio de fluorescência.</li>
</ol>7. Mancha ocidental
<ol><li>Adicionar 2 mL de suspensões de células 5 x 106 células/mL contendo diferentes fármacos em placas de 6 poços e cultura em estufa a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h. NOTA: Os grupos para a análise de western blot foram definidos da seguinte forma: grupo controle, grupo LY294002 (10 μM), grupo Sal (80 μM) e grupo LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Recolher as células e o sobrenadante e centrifugar a 560 × g a 4 °C durante 3 min. Descarte o sobrenadante e lave duas vezes com PBS pré-resfriado. Após cada lavagem, centrifugar as células a 560 × g a 4 °C durante 3 min.</li>
	<li>Adicionar 50 μL de tampão de lise à amostra celular do passo 7.2 para um banho de gelo de 15 minutos. Centrifugar a 8550 × g a 4 °C durante 10 min para recolher a amostra de proteína sobrenadante.</li>
	<li>Depois de detectar a concentração de proteínas usando um método BCA, misturar a amostra de proteína na etapa 7.3 com tampão de carga na proporção de 4:1, desnaturar a 100 °C por 10 min em banho de metal e resfriar até a temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicionar 20 μg da amostra de proteínas do passo 7.4, separar as proteínas com diferentes pesos moleculares35usando 10% SDS-PAGE (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, transferir para membranas de PVDF de 0,22 μm. Após o bloqueio com BSA a 5%, incubar as membranas com os anticorpos primários correspondentes durante a noite a 4 °C. NOTA: A concentração diluída dos seguintes anticorpos primários é de 1:1.000: caspase-9/7/3 clivada (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 e β-actina (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>No dia seguinte, incubar as membranas com anticorpo secundário IgG de cabra anti-coelho por 2 h a 37 °C. Desenvolva as membranas usando uma solução quimioluminescente ECL e capture imagens usando um sistema de imagem western blot quantitativo sem contato (consulte a Tabela de Materiais).</li>
</ol>8. qRT-PCR
<ol><li>Realizar centrifugação para coletar células MCF-7 a 560 x g a 4 °C por 3 min e adicionar 500 μL de tampão RL1 em 5 × 106 células. Sopre e misture repetidamente com uma pipeta até que nenhuma massa celular seja visível. NOTA: O tampão RL1 é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Transferir os homogeneizados celulares na etapa 8.1 para a coluna de limpeza de DNA embutida no tubo de coleta e centrifugar a 8.550 × g a 4 °C por 2 min. Remova a coluna de limpeza de DNA e mantenha o sobrenadante no tubo de coleta. NOTA: A coluna de limpeza de ADN e o tubo de recolha são dois dos componentes do kit de isolamento de ARN total (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Adicionar 800 μL de tampão RL2 a 500 μL do sobrenadante do passo 8.2 e misturar delicadamente. NOTA: O tampão RL2 é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais). Adicionar 120 mL de etanol anidro a 60 mL de tampão RL2 antes de usar.</li>
	<li>Transferir 700 μL da mistura do passo 8.3 para a coluna somente de RNA embutida no tubo de coleta e centrifugar a 8.550 × g a 4 °C por 1 min. Descarte os resíduos líquidos no tubo de coleta. NOTA: A coluna somente de RNA é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Repetir o passo 8.4 para processar a mistura restante do passo 8.3.</li>
	<li>Adicionar 500 μL de tampão RW1 à coluna somente de RNA e centrifugar a 8.550 × g a 4 °C por 1 min. Descarte os resíduos líquidos no tubo de coleta. NOTA: O buffer RW1 é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Adicionar 700 μL de tampão RW2 à coluna somente de RNA e centrifugar a 8.550 × g a 4 ◦C por 1 min. Descarte os resíduos líquidos no tubo de coleta. Repita a etapa 8.7 uma vez. NOTA: O tampão RW2 é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Coloque a coluna somente de RNA de volta no tubo de coleta e centrifugar a 8550 × g a 4 °C por 2 min para remover o tampão RW2 restante.</li>
	<li>Transfira a coluna somente de RNA para um novo tubo de coleta e goteje 100 μL de ddH2O livre de RNase pré-aquecido a 65 °C no centro da membrana para a coluna somente de RNA. Colocar a 25 °C durante 2 min e recolher a solução de ARN por centrifugação a 8.550 × g a 4 °C durante 1 min. NOTA: DDH2O livre de RNase é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Adicionar 4 μL de tampão de reacção 5x, 1 μL de primer oligo (dT)18 , 1 μL de primer hexâmero aleatório, 1 μL de primer gene-específico (ver Tabela 1), 1 μL de mistura enzimática e 5 μg da solução de ARN do passo 8.9 numa tira de 8 tubos de 100 μL. Completar o sistema de reação com água livre de RNase a 20 μL.</li>
	<li>Definir as condições de reação do sistema da seguinte forma: (1): 95 °C, 30 s, 1 ciclo; (2): 95 °C, 5 s, 50 ciclos, 60 °C, 34 s; (3): 95 °C, 5 s, 1 ciclo, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s; e (4): 42 °C, 30 s, 1 ciclo. Execute o procedimento qRT-PCR. NOTA: Os níveis de expressão relativa dos genes-alvo foram analisados quantitativamente pelo método 2−ΔΔCT 36,37. As informações dos primers de cada gene utilizado para a análise do qRT-PCR estão listadas na Tabela 1.</li>
</ol>9. Análise estatística
<ol><li>Expresse os dados como média ± desvio padrão de três experimentos independentes.</li>
	<li>Analise as comparações entre múltiplos grupos usando gráficos e softwares de análise (veja a Tabela de Materiais) com uma análise de variância (ANOVA) unidirecional seguida de um teste de Tukey. Neste trabalho, P < 0,05 foi definido como estatisticamente significante.</li>
</ol>

Mecanismo do salidrosídeo na supressão da migração e proliferação de células MCF-7

Os autores não têm nada a revelar.

O câncer de mama acomete indivíduos de todas as idades e causa incalculável sobrecarga física e mental e grande pressão econômica1. O câncer de mama, com sua crescente morbidade e mortalidade a cada ano, também tem atraído a atenção mundial na busca de terapias compostas fitoterápicas eficazes além dos tratamentos convencionais 4,5. De forma promissora, um grande corpo de evidências tem revelado os efeitos anticancerígenos d...

Como um dos cânceres mais comumente diagnosticados e malignidades mais comuns, as estatísticas mais recentes indicam que 2,3 milhões de casos de câncer de mama surgiram em todo o mundo até 2020, representando 11,7% de todos os casos de câncer1. Os sintomas comuns do câncer de mama incluem sensibilidade mamária e formigamento, nódulos e dor mamária, secreção mamilar, erosão ou pele afundada e linfonodos axilares aumentados 1,2. Ainda mais alarmante, o número de novos casos e a incidência geral de câncer de mama continuam a aumentar a uma taxa avassaladora a cada ano, sendo responsáveis por 6,9% das mortes relacionadas ao câncer1. Atualmente, a intervenção contra o câncer de mama ainda envolve principalmente quimioterapia, cirurgia, radioterapia e tratamento abrangente. Embora o tratamento possa efetivamente reduzir a taxa de recorrência e a taxa de mortalidade dos pacientes, a aplicação do tratamento em longo prazo frequentemente produz resistência a múltiplas drogas, queda de cabelo em grandes áreas, náuseas e vômitos e grave sobrecarga mental e psicológica 2,3. Notavelmente, o risco potencial de metástases de múltiplos órgãos do câncer de mama também força as pessoas a procurar novas fontes fitoterápicas de terapia medicamentosa 4,5.
A sinalização mediada pela fosfoinositida 3 quinase (PI3K) está implicada no crescimento, proliferação e sobrevida do câncer de mama por meio de splicing que afeta a expressão de múltiplos genes6. Como uma proteína sensível ao sinal a jusante da PI3K, numerosas evidências sugerem que a proteína quinase B (AKT) poderia acoplar-se ao alvo mamífero da proteína rapamicina (mTOR) para aumentar ainda mais o câncer de mama 7,8,9. Além disso, a desativação da sinalização PI3K/AKT/mTOR também tem sido reivindicada como um componente-chave em drogas que inibem a proliferação maligna e estimulam a apoptose no câncer de mama10,11,12. Sabe-se que a hipóxia extrema no microambiente tumoral força um aumento maciço do fator 1 alfa induzível por hipóxia (HIF-1α), o que piora ainda mais a progressão do câncer de mama13,14,15. Paralelamente, a estimulação com AKT também leva ao acúmulo excessivo de HIF-1α, limitando a apoptose em amostras de câncer de mama16,17. Curiosamente, a ativação da sinalização PI3K-AKT-HIF-1α foi confirmada como envolvida na progressão patológica e metástase em uma variedade de cânceres, incluindo câncer de pulmão18, câncer colorretal19, câncer de ovário20 e câncer de próstata21. Além de ser orquestrada pelo HIF-1α, a superexpressão do fator de transcrição cabeça bifurcada 1 (FoxO1) também é desencadeada pela estimulação da sinalização AKT, que promove a parada do ciclo e a inibição da apoptose em células do câncer de mama22,23. Juntas, as evidências sólidas acima sugerem que a inibição da cascata da sinalização PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 pode ser um novo alvo potencial para a terapia medicamentosa no câncer de mama.
O salidrosídeo (Sal) tem demonstrado amplamente exercer atividades farmacológicas antineoplásicas 24,25, anti-hipóxia26,27,28,29 e imunoestimulantes 30. É um pó marrom claro ou marrom que é facilmente solúvel em água, é um tipo de glicosídeo feniletanóide, e tem uma fórmula de estrutura química de C14H 20 O7 e um peso molecular de300,331,32. Investigações farmacológicas modernas têm demonstrado que o Sal pode promover a apoptose de células do câncer gástrico restringindo a sinalização PI3K-AKT-mTOR24. Outras evidências também sugerem que a supressão da sinalização PI3K-AKT-HIF-1α pelo tratamento com Sal pode contribuir para a apoptose de células cancerosas, aumentando sua sensibilidade a agentes quimioterápicos25. Evidências também sugerem que o Sal restringe a migração e invasão celular e causa a parada do ciclo por promover apoptose nas células MCF-7 do câncer de mama humano33,34. No entanto, resta saber se o Sal pode regular a sinalização PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 e inibir a proliferação maligna de células MCF-7. Portanto, este protocolo teve como objetivo explorar os efeitos do Sal na migração, invasão, ciclo celular e apoptose de células MCF-7 via via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. As estratégias de pesquisa integradas que incluem experimentos convencionais, de baixo custo e independentes, como avaliações de migração e invasão celular, apoptose e detecção do ciclo celular por citometria de fluxo, determinação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e fluorescência de Ca2+, etc., podem fornecer uma referência para o planejamento geral de experimentos para pesquisa anticâncer com a medicina fitoterápica tradicional. O processo experimental deste estudo é mostrado na Figura 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% penicillin/streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YT0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC/PI kit</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>AP101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax iD5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bax antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#5023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL521A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl-2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#15071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bim antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+&#8211;ATPase assay kit</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A070-4-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting kit-8</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BS350B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell cycle staining kit</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>CCS012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-3</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-7</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#8438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-9</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#20750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose culture medium</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-15142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL chemiluminescent solution</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL520B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Procell Life Science &#38; Technology Co., Ltd.</td>
			<td>164210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65634/65634eq01.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>S1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FoxO1 antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YT1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>70-GAR0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software</td>
			<td>La Jolla</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIF-1&#945; antibody</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>BF8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human breast cancer cell line MCF-7</td>
			<td>Procell Life Science &#38; Technology Co., Ltd.</td>
			<td>CL-0149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading buffer</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL502B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY294002</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTOR antibody</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>GB11405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+&#8211;K+&#8211;ATPase assay kit</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A070-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3K antibody</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>GB11525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-PI3K antibody</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>AF3241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative western blot imaging system</td>
			<td>Touch Image Pro</td>
			<td>eBlot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G3330-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROS assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>S0033S</td>
			<td>DCFH-DA fluorescence probe is included here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salidroside</td>
			<td>Chengdu Herbpurify Co., Ltd.</td>
			<td>H-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE kit</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G2003-50T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total RNA isolation kit</td>
			<td>Foregene</td>
			<td>RE-03014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>AF7018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the pharmacological action and molecular mechanism of salidroside in inhibiting mcf-7 cell proliferation and migration

Salidrosídeo (Sal) contém atividades farmacológicas anticarcinogênicas, anti-hipóxicas e anti-inflamatórias. No entanto, seus mecanismos subjacentes contra o câncer de mama foram apenas incompletamente elucidados. Assim, este protocolo pretendeu decodificar o potencial do Sal na regulação da via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 na proliferação maligna de células MCF-7 de câncer de mama humano. Primeiramente, a atividade farmacológica do Sal contra MCF-7 foi avaliada por CCK-8 e ensaios de arranhão celular. Além disso, a resistência das células MCF-7 foi medida por ensaios de migração e invasão de Matrigel. Para ensaios de apoptose celular e ciclo, as células MCF-7 foram processadas em etapas com anexina V-FITC/PI e kits de detecção de ciclo celular para análises por citometria de fluxo, respectivamente. Os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) e Ca2+ foram examinados pelas colorações de imunofluorescência DCFH-DA e Fluo-4 AM. As atividades da Na+-K+-ATPase e da Ca2+-ATPase foram determinadas utilizando os kits comerciais correspondentes. Os níveis de expressão gênica e proteica na apoptose e na via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 foram posteriormente determinados usando análises de western blot e qRT-PCR, respectivamente. Descobrimos que o tratamento com Sal restringiu significativamente a proliferação, migração e invasão de células MCF-7 com efeitos dose-dependentes. Enquanto isso, a administração do Sal também forçou dramaticamente as células MCF-7 a sofrer apoptose e parada do ciclo celular. Os testes de imunofluorescência mostraram que o Sal estimulou observavelmente a produção de ROS e Ca2+ em células MCF-7. Dados adicionais confirmaram que Sal promoveu os níveis de expressão de proteínas pró-apoptóticas, Bax, Bim, caspase-9/7/3 clivada e seus genes correspondentes. Consistentemente, a intervenção com Sal reduziu proeminentemente a expressão das proteínas Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α e FoxO1 e seus genes correspondentes. Em conclusão, o Sal pode ser usado como um potencial composto derivado de ervas para o tratamento do câncer de mama, pois pode reduzir a proliferação, migração e invasão malignas de células MCF-7 inibindo a via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

As one of the most commonly diagnosed cancers and most common malignancies, the latest statistics indicate that 2.3 million cases of breast cancer emerged around the world by 2020, accounting for 11.7% of all cancer cases1. Common symptoms of breast cancer include breast tenderness and tingling, breast lumps and pain, nipple discharge, erosion or sunken skin, and enlarged axillary lymph nodes1,2. Even more alarming, the number of new cases and the overall incidence of breast cancer continues to increase at an overwhelming rate each year, accounting for 6.9% of cancer-related deaths1. At present, breast cancer intervention still mainly involves chemotherapy, surgery, radiotherapy, and comprehensive treatment. Although treatment can effectively reduce the recurrence rate and mortality rate of patients, long-term treatment application often causes produce multidrug resistance, large-area hair loss, nausea and vomiting, and serious mental and psychological burden2,3. Notably, the potential risk of multiple organ metastases from breast cancer also forces people to seek novel herbal sources of drug therapy4,5.
Phosphoinositide 3 kinase (PI3K)-mediated signaling is implicated in the growth, proliferation, and survival of breast cancer through splicing that affects the expression of multiple genes6. As a downstream signal-sensing protein of PI3K, numerous evidence suggests that protein kinase B (AKT) could couple with the mammalian target of rapamycin (mTOR) protein to further increase breast cancer7,8,9. Moreover, the deactivation of PI3K/AKT/mTOR signaling has also been claimed to be a key component in drugs inhibiting malignant proliferation and stimulating apoptosis in breast cancer10,11,12. It is well known that extreme hypoxia in the tumor microenvironment forces a massive surge in hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1&#945;), which further worsens the progression of breast cancer13,14,15. In parallel, AKT stimulation also leads to excessive accumulation of HIF-1&#945;, limiting apoptosis in breast cancer samples16,17. Interestingly, the activation of PI3K-AKT-HIF-1&#945; signaling has been confirmed to be involved in pathologic progression and metastasis in a variety of cancers, including lung cancer18, colorectal cancer19, ovarian cancer20, and prostate cancer21. In addition to being orchestrated by HIF-1&#945;, forked head transcription factor 1 (FoxO1) overexpression is also triggered by AKT signaling stimulation, which promotes cycle arrest and the inhibition of apoptosis in breast cancer cells22,23. Together, the above solid evidence suggests that the inhibition of the cascade of PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 signaling may be a potential novel target for drug therapy in breast cancer.
Salidroside (Sal) has been widely demonstrated to exert anti-cancer24,25, anti-hypoxia26,27,28,29, and immune-enhancing pharmacological activities30. It is a light brown or brown powder that is easily soluble in water, is a type of phenylethanoid glycoside, and has a chemical structure formula of C14H20O7 and a molecular weight of 300.331,32. Modern pharmacological investigations have demonstrated that Sal can promote the apoptosis of gastric cancer cells by restraining PI3K-AKT-mTOR signaling24. Further evidence also suggests that the suppression of PI3K-AKT-HIF-1&#945; signaling by Sal treatment may contribute to the apoptosis of cancer cells by enhancing their sensitivity to chemotherapeutic agents25. Evidence also suggests that Sal restricts cell migration and invasion and causes cycle arrest by promoting apoptosis in the human breast cancer MCF-7 cells33,34. However, it remains to be seen whether Sal can regulate PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 signaling and inhibit the malignant proliferation of MCF-7 cells. Therefore, this protocol aimed to explore the effects of Sal on MCF-7 cell migration, invasion, cell cycle, and apoptosis via the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway. The integrated research strategies comprising conventional, low-cost, and independent experiments, such as cell migration and invasion assessments, apoptosis and cell cycle detection by flow cytometry, reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ fluorescence determination, etc., can provide a reference for the overall design of experiments for anti-cancer research with traditional herbal medicine. The experimental process of this study is shown in Figure 1.

Autor em destaque: Explorando os mecanismos moleculares do salidrosídeo no tratamento do câncer de mama 

Explorando a Ação Farmacológica e o Mecanismo Molecular do Salidrosídeo na Inibição da Proliferação e Migração de Células MCF-7

Efeitos do Sal na inibição do excesso de proliferação e retardo da cicatrização de feridas em células MCF-7 Para sondar o potencial do Sal contra o câncer de mama, primeiro testamos suas propriedades anticancerígenas usando ensaios de toxicidade de proliferação celular e arranhões da linhagem celular MCF-7 do câncer de mama humano. Essas células foram co-incubadas com uma série de concentração de Sal (5-320 μM) por 24 h, e a proliferação celular foi avaliada usando um ensaio CCK-8....

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O presente protocolo descreve uma estratégia abrangente para avaliar a ação farmacológica e o mecanismo do salidrosídeo na inibição da proliferação e migração de células MCF-7.

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer ...

Nós nos concentramos em explorar compostos ativos derivados de produtos naturais e seu potencial no tratamento do câncer de mama. Assim, especificamente, pretendemos elucidar os efeitos farmacológicos do salidrósido e seus mecanismos moleculares na combinação do câncer de mama. Atualmente, faltam técnicas experimentais confiáveis para validar os alvos moleculares do salidrósido no tratamento do câncer de mama.Um achado significativo no campo é um potencial mecanismo molecular do salidrósido em aumentar a proliferação e migração de células MCF7 através da regulação da sinalização PI3K/AKT/HIF-1 alfa/FoxO1. A pesquisa futura do laboratório é explorar diretamente os mecanismos fisiopatológicos subjacentes ao início, desenvolvimento, prognóstico e desfecho do câncer de mama. Além disso, rastreamos pequenas drogas moleculares ativas derivadas de fontes naturais que podem agregar na prevenção e tratamento do câncer de mama.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration

925 visualizações.  Suining Central Hospital. Nós nos concentramos em explorar compostos ativos derivados de produtos naturais e seu potencial no tratamento do câncer de mama. Assim, especificamente, pretendemos elucidar os efeitos farmacológicos do salidrósido e seus mecanismos moleculares na combinação do câncer de mama. Atualmente, faltam técnicas experimentais confiáveis para validar os alvos moleculares do salidrósido no tratamento do câncer de mama.Um achado significativo no campo é um potencial mecanismo molecul...

Vídeo: Autor em destaque: Explorando os mecanismos moleculares do salidrosídeo no tratamento do câncer de mama 

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer mechanisms have been only incompletely elucidated. Hence, this protocol intended to decode the potential of Sal in regulating the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway in the malignant proliferation of human breast cancer MCF-7 cells. First, the pharmacological activity of Sal against MCF-7 was evaluated by CCK-8 and cell scratch assays. Moreover, the resistance of MCF-7 cells was measured by migration and Matrigel invasion assays. For cell apoptosis and cycle assays, MCF-7 cells were processed in steps with annexin V-FITC/PI and cell cycle-staining detection kits for flow cytometry analyses, respectively. The levels of reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ were examined by DCFH-DA and Fluo-4 AM immunofluorescence staining. The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were determined using the corresponding commercial kits. The protein and gene expression levels in apoptosis and the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway were further determined using western blot and qRT-PCR analyses, respectively. We found that Sal treatment significantly restricted the proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells with dose-dependent effects. Meanwhile, Sal administration also dramatically forced MCF-7 cells to undergo apoptosis and cell cycle arrest. The immunofluorescence tests showed that Sal observably stimulated ROS and Ca2+ production in MCF-7 cells. Further data confirmed that Sal promoted the expression levels of pro-apoptotic proteins, Bax, Bim, cleaved caspase-9/7/3, and their corresponding genes. Consistently, Sal intervention prominently reduced the expression of the Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1&#945;, and FoxO1 proteins and their corresponding genes. In conclusion, Sal can be used as a potential herb-derived compound for treating breast cancer, as it may reduce the malignant proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells by inhibiting the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway.

The present protocol describesa comprehensive strategy for evaluating the pharmacological action and mechanism of salidroside in inhibiting MCF-7 cell proliferation and migration.