Bu çalışma Sichuan Eyaleti Sağlık Komisyonu (120025) tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışma için kullanılan MCF-7 hücreleri ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.
1. Hücre kültürü
<ol><li>MCF-7 hücrelerini, %10 FBS ve %1 penisilin (10.000 U/mL)/streptomisin (10.000 μg/mL) içeren DMEM ile 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 CO 2 atmosferinde kültürleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). NOT: Deneyin için çanağın tabanının %90'ını kaplayan hücreler kullanıldı ve aşağıdaki gruplara ayrıldı: kontrol grubu, doksorubisin hidroklorür grubu (DXR, 5 μM) ve Sal grupları (20 μM, 40 μM ve 80 μM) veya kontrol grubu, LY294002 (10 μM, bir PI3K inhibitörü) grubu, Sal (80 μM) grubu ve LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) grubu ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
</ol>2. Hücre canlılığı testi
NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için lütfen önceki bir raporabakın 27.
<ol><li>96 oyuklu plakalarda 8 x 104 hücre/kuyu yoğunluğuna sahip MCF-7 hücrelerini tohumlayın ve hücreler yapışana kadar gece boyunca Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM ve 320 μM) ile inkübe edin veya Sal (20, 40, 80 μM) 12 saat / 24 saat / 36 saat / 48 saat boyunca.</li>
	<li>İşlemden sonra, MCF-7 hücrelerini 10 μL / kuyu CCK-8 çözeltisi ile 2 saat boyunca birlikte inkübe edin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Ardından, otomatik bir mikroplaka okuyucu ile optik yoğunluğu 450 nm'de (OD450) ölçün.</li>
</ol>3. Hücre göçü ve istilası
NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için lütfen önceki bir raporabakın 35.
<ol><li>Yemeğin tabanının %90'ını kaplayacak şekilde 6 oyuklu plakalara ekilmiş 2 mL 5 x 106 hücre/mL hücreyi inkübe edin.</li>
	<li>Steril bir pipet ucu ile hücre tek tabakasının merkezi boyunca doğrusal bir çizik sarımı gerçekleştirin. 0 saat, 24 saat ve 48 saatte optik mikroskop kullanarak görüntüler elde edin.</li>
	<li>Çizik yaralarının genişliğini ölçmek için Image J yazılımını kullanın.</li>
	<li>Transwell testi için, MCF-7 hücrelerini serum ortamı olmadan askıya alın ve Matrigel ile veya Matrigel olmadan önceden kaplanmış üst transwell odasında tohumlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Transwell odasının dibinde, kimyasal bir indükleyici olarak DMEM tam ortamı kullanın. 24 saat sonra, üst odadaki hücreleri çıkarın ve kalan istilacı ve göçmen hücreleri metanol35'e sabitleyin.</li>
	<li>MCF-7 hücrelerini kristal viyole solüsyonu ile boyayın ( Malzeme Tablosuna bakın). Optik mikroskop kullanarak görüntüleri yakalayın.</li>
</ol>4. Na + - K + -ATPaz ve Ca 2 + - Mg2 + -ATPaz'ın aktivite değerlendirmesi
<ol><li>Üreticinin talimatlarını izleyerek parçalanmış MCF-7 hücrelerindeki protein konsantrasyonunu ölçmek için bir bikinkoninik asit (BCA) kiti kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).<ol><li>Parçalanmış hücrelerin örneklerini karşılık gelen gruplarında 96 oyuklu plakalara ekleyin. Bundan sonra, 37 ° C'de 5 dakika inkübe etmek için çalışma solüsyonunu ekleyin. Son olarak, OD636 değerlerini çok işlevli bir mikroplaka okuyucu ile ölçün.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Apoptoz ve hücre döngüsünün akış sitometrisi analizi
NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için lütfen önceki bir raporabakın 31.
<ol><li>Hücreleri sindirin ve ekin V-FITC ve propidyum iyodür (PI) ile 20 dakikalık bir boyama için fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse etmek için hasat edin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve ardından bir akış sitometresi kullanarak apoptotik hücrelerin sayısını belirleyin.</li>
	<li>Yeniden süspanse edilmiş numune çözeltisini 30 dakikalık bir inkübasyon için PI çözeltisi ile karıştırın, ardından bir akış sitometresi ile tespit edin.</li>
</ol>6. DCFH-DA ve Fluo-4 floresan boyama
NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için lütfen önceki bir raporabakın 29.
<ol><li>MCF-7 hücrelerini 37 °C'de 10 μM DCFH-DA floresan probu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile 20 dakika inkübe edin. PBS ile üç kez yıkayarak fazla DCFH-DA'yı iyice çıkardıktan sonra, bir floresan mikroskobu kullanarak sırasıyla 488 nm ve 525 nm uyarma ve emisyon dalga boylarında floresan yoğunluğunu test edin.</li>
	<li>MCF-7 hücrelerini 5 μM Fluo-4 floresan prob çözeltisi ile 37 °C'de 45 dakika inkübe edin. PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, bir floresan mikroskobu kullanarak sırasıyla 488 nm ve 516 nm uyarma ve emisyon dalga boylarında floresan yoğunluk değerlerini belirleyin.</li>
</ol>7. Batı lekesi
<ol><li>6 oyuklu plakalara farklı ilaçlar içeren 2 mL 5 x 106 hücre/mL hücre süspansiyonu ekleyin ve 24 saat boyunca 37 °C,% 5CO2 inkübatörde kültürleyin. NOT: Western blot analizi için gruplar şu şekilde belirlenmiştir: kontrol grubu, LY294002 (10 μM) grubu, Sal (80 μM) grubu ve LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) grubu ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Hücreleri ve süpernatanı toplayın ve 560 × g'da 4 ° C'de 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve önceden soğutulmuş PBS ile iki kez yıkayın. Her yıkamadan sonra hücreleri 560 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>15 dakikalık bir buz banyosu için 7.2. adımdan hücre örneğine 50 μL lizis tamponu ekleyin. Süpernatan protein örneğini toplamak için 8550 × g'de 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Bir BCA yöntemi kullanarak protein konsantrasyonunu tespit ettikten sonra, protein örneğini adım 7.3'te 4:1 oranında yükleme tamponu ile karıştırın, metal bir banyoda 100 °C'de 10 dakika denatüre edin ve oda sıcaklığına soğutun.</li>
	<li>Adım 7.4'ten 20 μg protein numunesi ekleyin, %10 SDS-PAGE kullanarak farklı moleküler ağırlıklara35sahip proteinleri ayırın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ardından 0.22 μm PVDF membranlarına aktarın. % 5 BSA ile blokajdan sonra, membranları karşılık gelen primer antikorlarla gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. NOT: Aşağıdaki primer antikorların seyreltik konsantrasyonu 1:1.000'dir: bölünmüş kaspaz-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 ve β-aktin (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Ertesi gün, membranları keçi anti-tavşan IgG sekonder antikoru ile 37 ° C'de 2 saat inkübe edin. Bir ECL kemilüminesan çözeltisi kullanarak membranları geliştirin ve temassız bir kantitatif western blot görüntüleme sistemi kullanarak görüntüleri yakalayın (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
</ol>8. qRT-PCR
<ol><li>MCF-7 hücrelerini 3 dakika boyunca 4 ° C'de 560 x g'de toplamak için santrifüjleme yapın ve 5 × 106 hücreye 500 μL tampon RL1 ekleyin. Üfleyin ve hiçbir hücre kütlesi görünmeyene kadar bir pipetle tekrar tekrar karıştırın. NOT: Tampon RL1, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Adım 8.1'deki hücre homojenatlarını toplama tüpüne gömülü DNA temizleme kolonuna aktarın ve 2 dakika boyunca 4 ° C'de 8.550 × g'da santrifüjleyin. DNA temizleme kolonunu çıkarın ve süpernatanı toplama tüpünde tutun. NOT: DNA temizleme sütunu ve toplama tüpü, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden ikisidir (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Adım 8.2'den itibaren 500 μL süpernatan için 800 μL tampon RL2 ekleyin ve hafifçe karıştırın. NOT: Tampon RL2, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir ( Malzeme Tablosuna bakın). Kullanmadan önce 60 mL tampon RL2'ye 120 mL susuz etanol ekleyin.</li>
	<li>Adım 8.3'teki karışımın 700 μL'sini toplama tüpüne gömülü yalnızca RNA kolonuna aktarın ve 1 dakika boyunca 4 ° C'de 8.550 × g'da santrifüjleyin. Atık sıvıyı toplama tüpüne atın. NOT: Yalnızca RNA sütunu, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Adım 8.3'ten kalan karışımı işlemek için adım 8.4'ü tekrarlayın.</li>
	<li>Yalnızca RNA kolonuna 500 μL tampon RW1 ekleyin ve 1 dakika boyunca 4 ° C'de 8.550 × g'da santrifüjleyin. Atık sıvıyı toplama tüpüne atın. NOT: Tampon RW1, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir ( Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Yalnızca RNA kolonuna 700 μL tampon RW2 ekleyin ve 1 dakika boyunca 4 ◦C'de 8.550 × g'de santrifüjleyin. Atık sıvıyı toplama tüpüne atın. Adım 8.7'yi bir kez tekrarlayın. NOT: Tampon RW2, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir ( Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Yalnızca RNA kolonunu toplama tüpüne geri yerleştirin ve kalan tampon RW2'yi çıkarmak için 8550 × g'de 4 °C'de 2 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Yalnızca RNA kolonunu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve 65 ° C'de önceden ısıtılmış 100 μL RNaz içermeyen ddH2O'yu yalnızca RNA sütunu için zarın merkezine damlatın. 25 °C'de 2 dakika bekletin ve RNA çözeltisini 1 dakika boyunca 4 °C'de 8.550 × g'da santrifüjleyerek toplayın. NOT: RNaz içermeyen ddH2O, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir ( Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>4 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL oligo (dT)18 primeri, 1 μL rastgele heksamer primeri, 1 μL gene özgü primer (bakınız Tablo 1), 1 μL enzim karışımı ve 5 μg ekleyin RNA çözeltisi adım 8.9'dan 100 μL 8 tüplü bir şeride yerleştirin. Reaksiyon sistemini 20 μL'ye kadar RNaz içermeyen su ile destekleyin.</li>
	<li>Sistemin reaksiyon koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: (1): 95 °C, 30 s, 1 döngü; (2): 95 °C, 5 sn, 50 döngü, 60 °C, 34 sn; (3): 95 °C, 5 sn, 1 döngü, 65 °C, 60 sn, 97 °C, 1 sn; ve (4): 42 °C, 30 sn, 1 döngü. qRT-PCR prosedürünü yürütün. NOT: Hedef genlerin nispi ekspresyon seviyeleri 2−ΔΔCT yöntemi36,37 ile kantitatif olarak analiz edildi. qRT-PCR analizi için kullanılan her bir genin primer bilgisi Tablo 1'de listelenmiştir.</li>
</ol>9. İstatistiksel analiz
<ol><li>Verileri, üç bağımsız deneyin ortalama ± standart sapması olarak ifade edin.</li>
	<li>Grafik ve analiz yazılımı kullanarak birden fazla grup arasındaki karşılaştırmaları analiz edin (Malzeme Tablosuna bakınız) tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından bir Tukey testi ile. Bu çalışmada P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak tanımlanmıştır.</li>
</ol>

Salidrosid'in MCF-7 Hücre Göçünü ve Proliferasyonunu Baskılama Mekanizması

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Meme kanseri her yaştan bireyi etkilemekte ve hesaplanamayan fiziksel ve zihinsel yüke ve büyük ekonomik baskıya neden olmaktadır1. Meme kanseri, her geçen yıl artan morbidite ve mortalitesi ile konvansiyonel tedavilerin ötesinde etkili bitkisel bazlı bileşik tedaviler arayışı açısından da dünya çapında ilgi görmektedir 4,5. Umut verici bir şekilde, çok sayıda kanıt Sal 24,25,38'in</sup...

En sık teşhis edilen kanserlerden ve en yaygın malignitelerden biri olan son istatistikler, 2020 yılına kadar dünya çapında 2,3 milyon meme kanseri vakasının ortaya çıktığını ve tüm kanser vakalarının %11,7'sini oluşturduğunu göstermektedir1. Meme kanserinin yaygın semptomları arasında memede hassasiyet ve karıncalanma, memede yumrular ve ağrı, meme başı akıntısı, erozyon veya çökük cilt ve genişlemiş koltuk altı lenf düğümleribulunur 1,2. Daha da endişe verici olanı, yeni vakaların sayısı ve genel meme kanseri insidansı her yıl ezici bir oranda artmaya devam ediyor ve kansere bağlı ölümlerin %6,9'unu oluşturuyor1. Şu anda, meme kanseri müdahalesi hala esas olarak kemoterapi, cerrahi, radyoterapi ve kapsamlı tedaviyi içermektedir. Tedavi, hastaların nüks oranını ve mortalite oranını etkili bir şekilde azaltabilse de, uzun süreli tedavi uygulaması sıklıkla çoklu ilaç direncine, geniş alan saç dökülmesine, bulantı ve kusmaya ve ciddi zihinsel ve psikolojik yüke neden olur 2,3. Özellikle, meme kanserinden kaynaklanan çoklu organ metastazı riski, insanları yeni bitkisel ilaç tedavisi kaynakları aramaya zorlamaktadır 4,5.
Fosfoinositid 3 kinaz (PI3K) aracılı sinyalleme, çoklu genlerin ekspresyonunu etkileyen ekleme yoluyla meme kanserinin büyümesi, çoğalması ve hayatta kalmasındarol oynar 6. PI3K'nın aşağı akış sinyal algılayıcı bir proteini olarak, çok sayıda kanıt, protein kinaz B'nin (AKT) meme kanserini daha da artırmak için memeli rapamisin (mTOR) proteini hedefi ile birleşebileceğini düşündürmektedir 7,8,9. Ayrıca, PI3K/AKT/mTOR sinyalinin devre dışı bırakılmasının, meme kanserinde malign proliferasyonu inhibe eden ve apoptozu uyaran ilaçlarda da önemli bir bileşen olduğu iddia edilmiştir10,11,12. Tümör mikroçevresindeki aşırı hipoksin, hipoksi ile indüklenebilir faktör 1 alfa'da (HIF-1α) büyük bir artışa neden olduğu ve bu da meme kanserinin ilerlemesini daha da kötüleştirdiğiiyi bilinmektedir 13,14,15. Buna paralel olarak, AKT stimülasyonu da aşırı HIF-1α birikimine yol açarak meme kanseri örneklerinde apoptozu sınırlar16,17. İlginç bir şekilde, PI3K-AKT-HIF-1α sinyalinin aktivasyonunun, akciğer kanseri18, kolorektal kanser19, yumurtalık kanseri 20 ve prostat kanseri21 dahil olmak üzere çeşitli kanserlerde patolojik ilerleme ve metastazda rol oynadığı doğrulanmıştır. HIF-1α tarafından düzenlenmesine ek olarak, çatallı kafa transkripsiyon faktörü 1 (FoxO1) aşırı ekspresyonu, meme kanseri hücrelerinde döngü durmasını ve apoptozun inhibisyonunu destekleyen AKT sinyal stimülasyonu tarafından da tetiklenir22,23. Birlikte, yukarıdaki sağlam kanıtlar, PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 sinyalinin kaskadının inhibisyonunun meme kanserinde ilaç tedavisi için potansiyel yeni bir hedef olabileceğini düşündürmektedir.
Salidrosidin (Sal) anti-kanser24,25, anti-hipoksi 26,27,28,29 ve bağışıklık arttırıcı farmakolojik aktiviteler30 uyguladığı yaygın olarak gösterilmiştir. Suda kolayca çözünebilen, bir tür feniletilanoid glikozit olan ve kimyasal yapı formülüC14H20O7ve moleküler ağırlığı 300.331,32 olan açık kahverengi veya kahverengi bir tozdur. Modern farmakolojik araştırmalar, Sal'ın PI3K-AKT-mTOR sinyalini24 kısıtlayarak mide kanseri hücrelerinin apoptozunu destekleyebileceğini göstermiştir. Daha fazla kanıt ayrıca, PI3K-AKT-HIF-1α sinyalinin Sal tedavisi ile baskılanmasının, kemoterapötik ajanlara duyarlılıklarını artırarak kanser hücrelerinin apoptozuna katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir25. Kanıtlar ayrıca Sal'ın hücre göçünü ve istilasını kısıtladığını ve insan meme kanseri MCF-7 hücrelerinde apoptozu teşvik ederek döngü durmasına neden olduğunu göstermektedir33,34. Bununla birlikte, Sal'ın PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 sinyalini düzenleyip düzenleyemeyeceği ve MCF-7 hücrelerinin malign proliferasyonunu inhibe edip edemeyeceği henüz belli değil. Bu nedenle, bu protokol, Sal'ın PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolu yoluyla MCF-7 hücre göçü, invazyonu, hücre döngüsü ve apoptoz üzerindeki etkilerini araştırmayı amaçladı. Hücre göçü ve invazyon değerlendirmeleri, akış sitometrisi ile apoptoz ve hücre döngüsü tespiti, reaktif oksijen türleri (ROS) ve Ca2 + floresan tayini gibi geleneksel, düşük maliyetli ve bağımsız deneyleri içeren entegre araştırma stratejileri, geleneksel bitkisel ilaçlarla anti-kanser araştırmaları için deneylerin genel tasarımı için bir referans sağlayabilir. Bu çalışmanın deneysel süreci Şekil 1'de gösterilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% penicillin/streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YT0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC/PI kit</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>AP101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax iD5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bax antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#5023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL521A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl-2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#15071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bim antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+&#8211;ATPase assay kit</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A070-4-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting kit-8</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BS350B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell cycle staining kit</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>CCS012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-3</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-7</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#8438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-9</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#20750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose culture medium</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-15142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL chemiluminescent solution</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL520B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Procell Life Science &#38; Technology Co., Ltd.</td>
			<td>164210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65634/65634eq01.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>S1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FoxO1 antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YT1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>70-GAR0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software</td>
			<td>La Jolla</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIF-1&#945; antibody</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>BF8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human breast cancer cell line MCF-7</td>
			<td>Procell Life Science &#38; Technology Co., Ltd.</td>
			<td>CL-0149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading buffer</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL502B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY294002</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTOR antibody</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>GB11405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+&#8211;K+&#8211;ATPase assay kit</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A070-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3K antibody</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>GB11525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-PI3K antibody</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>AF3241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative western blot imaging system</td>
			<td>Touch Image Pro</td>
			<td>eBlot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G3330-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROS assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>S0033S</td>
			<td>DCFH-DA fluorescence probe is included here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salidroside</td>
			<td>Chengdu Herbpurify Co., Ltd.</td>
			<td>H-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE kit</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G2003-50T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total RNA isolation kit</td>
			<td>Foregene</td>
			<td>RE-03014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>AF7018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the pharmacological action and molecular mechanism of salidroside in inhibiting mcf-7 cell proliferation and migration

Salidrosid (Sal), anti-kanserojen, anti-hipoksik ve anti-inflamatuar farmakolojik aktiviteler içerir. Bununla birlikte, altta yatan anti-meme kanseri mekanizmaları tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu nedenle, bu protokol, insan meme kanseri MCF-7 hücrelerinin malign proliferasyonunda PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolunu düzenlemede Sal'ın potansiyelini çözmeyi amaçladı. İlk olarak, Sal'ın MCF-7'ye karşı farmakolojik aktivitesi CCK-8 ve hücre çizik testleri ile değerlendirildi. Ayrıca, MCF-7 hücrelerinin direnci migrasyon ve Matrigel invazyon testleri ile ölçüldü. Hücre apoptozu ve siklus tahlilleri için, MCF-7 hücreleri, akış sitometrisi analizleri için sırasıyla annexin V-FITC/PI ve hücre döngüsü boyama tespit kitleri ile adım adım işlendi. Reaktif oksijen türleri (ROS) ve Ca2+ düzeyleri DCFH-DA ve Fluo-4 immünofloresan boyama ile incelendi. Na+-K+-ATPaz veCa2+-ATPaz aktiviteleri, ilgili ticari kitler kullanılarak belirlendi. Apoptozdaki protein ve gen ekspresyon seviyeleri ve PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolağı sırasıyla western blot ve qRT-PCR analizleri kullanılarak belirlendi. Sal tedavisinin, doza bağlı etkilerle MCF-7 hücrelerinin çoğalmasını, göçünü ve invazyonunu önemli ölçüde kısıtladığını bulduk. Bu arada, Sal uygulaması ayrıca MCF-7 hücrelerini apoptoz ve hücre döngüsü durmasına maruz kalmaya zorladı. İmmünofloresan testleri, Sal'ın MCF-7 hücrelerinde ROS ve Ca2+ üretimini gözle görülür şekilde uyardığını gösterdi. Diğer veriler, Sal'ın pro-apoptotik proteinlerin, Bax, Bim, bölünmüş kaspaz-9/7/3 ve bunlara karşılık gelen genlerin ekspresyon seviyelerini desteklediğini doğruladı. Tutarlı bir şekilde, Sal müdahalesi Bcl-2, p-PI3K / PI3K, p-AKT / AKT, mTOR, HIF-1α ve FoxO1 proteinlerinin ve bunlara karşılık gelen genlerin ekspresyonunu belirgin şekilde azalttı. Sonuç olarak, Sal, PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolunu inhibe ederek MCF-7 hücrelerinin malign proliferasyonunu, göçünü ve istilasını azaltabileceğinden, meme kanserini tedavi etmek için potansiyel bir bitki türevi bileşik olarak kullanılabilir.

As one of the most commonly diagnosed cancers and most common malignancies, the latest statistics indicate that 2.3 million cases of breast cancer emerged around the world by 2020, accounting for 11.7% of all cancer cases1. Common symptoms of breast cancer include breast tenderness and tingling, breast lumps and pain, nipple discharge, erosion or sunken skin, and enlarged axillary lymph nodes1,2. Even more alarming, the number of new cases and the overall incidence of breast cancer continues to increase at an overwhelming rate each year, accounting for 6.9% of cancer-related deaths1. At present, breast cancer intervention still mainly involves chemotherapy, surgery, radiotherapy, and comprehensive treatment. Although treatment can effectively reduce the recurrence rate and mortality rate of patients, long-term treatment application often causes produce multidrug resistance, large-area hair loss, nausea and vomiting, and serious mental and psychological burden2,3. Notably, the potential risk of multiple organ metastases from breast cancer also forces people to seek novel herbal sources of drug therapy4,5.
Phosphoinositide 3 kinase (PI3K)-mediated signaling is implicated in the growth, proliferation, and survival of breast cancer through splicing that affects the expression of multiple genes6. As a downstream signal-sensing protein of PI3K, numerous evidence suggests that protein kinase B (AKT) could couple with the mammalian target of rapamycin (mTOR) protein to further increase breast cancer7,8,9. Moreover, the deactivation of PI3K/AKT/mTOR signaling has also been claimed to be a key component in drugs inhibiting malignant proliferation and stimulating apoptosis in breast cancer10,11,12. It is well known that extreme hypoxia in the tumor microenvironment forces a massive surge in hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1&#945;), which further worsens the progression of breast cancer13,14,15. In parallel, AKT stimulation also leads to excessive accumulation of HIF-1&#945;, limiting apoptosis in breast cancer samples16,17. Interestingly, the activation of PI3K-AKT-HIF-1&#945; signaling has been confirmed to be involved in pathologic progression and metastasis in a variety of cancers, including lung cancer18, colorectal cancer19, ovarian cancer20, and prostate cancer21. In addition to being orchestrated by HIF-1&#945;, forked head transcription factor 1 (FoxO1) overexpression is also triggered by AKT signaling stimulation, which promotes cycle arrest and the inhibition of apoptosis in breast cancer cells22,23. Together, the above solid evidence suggests that the inhibition of the cascade of PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 signaling may be a potential novel target for drug therapy in breast cancer.
Salidroside (Sal) has been widely demonstrated to exert anti-cancer24,25, anti-hypoxia26,27,28,29, and immune-enhancing pharmacological activities30. It is a light brown or brown powder that is easily soluble in water, is a type of phenylethanoid glycoside, and has a chemical structure formula of C14H20O7 and a molecular weight of 300.331,32. Modern pharmacological investigations have demonstrated that Sal can promote the apoptosis of gastric cancer cells by restraining PI3K-AKT-mTOR signaling24. Further evidence also suggests that the suppression of PI3K-AKT-HIF-1&#945; signaling by Sal treatment may contribute to the apoptosis of cancer cells by enhancing their sensitivity to chemotherapeutic agents25. Evidence also suggests that Sal restricts cell migration and invasion and causes cycle arrest by promoting apoptosis in the human breast cancer MCF-7 cells33,34. However, it remains to be seen whether Sal can regulate PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 signaling and inhibit the malignant proliferation of MCF-7 cells. Therefore, this protocol aimed to explore the effects of Sal on MCF-7 cell migration, invasion, cell cycle, and apoptosis via the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway. The integrated research strategies comprising conventional, low-cost, and independent experiments, such as cell migration and invasion assessments, apoptosis and cell cycle detection by flow cytometry, reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ fluorescence determination, etc., can provide a reference for the overall design of experiments for anti-cancer research with traditional herbal medicine. The experimental process of this study is shown in Figure 1.

Yazar Spotlight: Meme Kanseri Tedavisinde Salidrosid'in Moleküler Mekanizmalarını Keşfetmek 

MCF-7 Hücre Proliferasyonunu ve Migrasyonunu İnhibe Etmede Salidrosidin Farmakolojik Etkisinin ve Moleküler Mekanizmasının Araştırılması

Sal'ın MCF-7 hücrelerinde aşırı proliferasyonu inhibe etme ve yara iyileşmesini geciktirme üzerindeki etkileri Sal'ın meme kanserine karşı potansiyelini araştırmak için, ilk önce insan meme kanseri MCF-7 hücre hattının hücre proliferasyon toksisitesi ve çizik testlerini kullanarak antikanser özelliklerini test ettik. Bu hücreler, 24 saat boyunca bir Sal konsantrasyon serisi (5-320 μM) ile birlikte inkübe edildi ve hücre proliferasyonu bir CCK-8 testi kullanılarak değerlendiri...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Salidroside's Molecular Mechanisms in Breast Cancer Treatment at JoVE.com

Mevcut protokol, MCF-7 hücre proliferasyonunu ve göçünü inhibe etmede salidrosidin farmakolojik etkisini ve mekanizmasını değerlendirmek için kapsamlı bir stratejiyi tanımlamaktadır.

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer ...

Doğal ürünlerden elde edilen aktif bileşikleri ve bunların meme kanseri tedavisindeki potansiyellerini keşfetmeye odaklanıyoruz. Bu nedenle spesifik olarak meme kanserinin kombinesinde salidrosidin farmakolojik etkilerini ve moleküler mekanizmalarını aydınlatmayı amaçlıyoruz. Şu anda, meme kanseri tedavisinde salidrositin moleküler hedeflerini doğrulamak için güvenilir deneysel teknikler eksiktir.Alandaki önemli bir bulgu, PI3K / AKT / HIF-1 alfa / FoxO1 sinyalinin düzenlenmesi yoluyla MCF7 hücrelerinin proliferasyonunu ve göçünü arttırmada salidrositin potansiyel bir moleküler mekanizmasıdır. Laboratuvarın gelecekteki araştırmaları doğrudan meme kanseri başlangıcının, gelişiminin, prognozunun ve sonucunun altında yatan patofizyolojik mekanizmaları araştırmaktır. Ek olarak, meme kanserinin önlenmesi ve tedavisine katkıda bulunabilecek doğal kaynaklardan elde edilen aktif küçük moleküler ilaçları tarıyoruz.

exploring-pharmacological-action-molecular-mechanism-salidroside

Research

JoVE Journal

Medicine

Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration

925 Görüntüleme.  Suining Central Hospital. Doğal ürünlerden elde edilen aktif bileşikleri ve bunların meme kanseri tedavisindeki potansiyellerini keşfetmeye odaklanıyoruz. Bu nedenle spesifik olarak meme kanserinin kombinesinde salidrosidin farmakolojik etkilerini ve moleküler mekanizmalarını aydınlatmayı amaçlıyoruz. Şu anda, meme kanseri tedavisinde salidrositin moleküler hedeflerini doğrulamak için güvenilir deneysel teknikler eksiktir.Alandaki önemli bir bulgu, PI3K / AKT / HIF-1 alfa / FoxO1 sinyalinin ...

Video: Yazar Spotlight: Meme Kanseri Tedavisinde Salidrosid'in Moleküler Mekanizmalarını Keşfetmek 

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer mechanisms have been only incompletely elucidated. Hence, this protocol intended to decode the potential of Sal in regulating the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway in the malignant proliferation of human breast cancer MCF-7 cells. First, the pharmacological activity of Sal against MCF-7 was evaluated by CCK-8 and cell scratch assays. Moreover, the resistance of MCF-7 cells was measured by migration and Matrigel invasion assays. For cell apoptosis and cycle assays, MCF-7 cells were processed in steps with annexin V-FITC/PI and cell cycle-staining detection kits for flow cytometry analyses, respectively. The levels of reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ were examined by DCFH-DA and Fluo-4 AM immunofluorescence staining. The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were determined using the corresponding commercial kits. The protein and gene expression levels in apoptosis and the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway were further determined using western blot and qRT-PCR analyses, respectively. We found that Sal treatment significantly restricted the proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells with dose-dependent effects. Meanwhile, Sal administration also dramatically forced MCF-7 cells to undergo apoptosis and cell cycle arrest. The immunofluorescence tests showed that Sal observably stimulated ROS and Ca2+ production in MCF-7 cells. Further data confirmed that Sal promoted the expression levels of pro-apoptotic proteins, Bax, Bim, cleaved caspase-9/7/3, and their corresponding genes. Consistently, Sal intervention prominently reduced the expression of the Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1&#945;, and FoxO1 proteins and their corresponding genes. In conclusion, Sal can be used as a potential herb-derived compound for treating breast cancer, as it may reduce the malignant proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells by inhibiting the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway.

The present protocol describesa comprehensive strategy for evaluating the pharmacological action and mechanism of salidroside in inhibiting MCF-7 cell proliferation and migration.

Tıp

Evaluating the Migration and Invasion of Salidroside Treated MCF-7 Cells in a Wound Scratch Assay

Salidrosid ile Tedavi Edilmiş MCF-7 Hücrelerinin Bir Yara Çizik Testinde Migrasyon ve İnvazyonunun Değerlendirilmesi

Determining Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase Activity in Salidroside Treated MCF-7 Cells

Salidrosid ile Tedavi Edilen MCF-7 Hücrelerinde Na+-K+-ATPaz ve Ca 2+-Mg2+-ATPaz Aktivitesinin Belirlenmesi