تم دعم هذا العمل من قبل لجنة الصحة في مقاطعة سيتشوان (120025).

تم الحصول على خلايا MCF-7 المستخدمة في هذه الدراسة من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
1. ثقافة الخلية
<ol><li>قم بزراعة خلايا MCF-7في جو CO 2 مرطب بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية مع DMEM يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين (10000 وحدة / مل) / ستربتومايسين (10000 ميكروغرام / مل) (انظر جدول المواد). ملاحظة: تم استخدام الخلايا التي تغطي 90٪ من قاع الطبق للتجربة وتم تعيينها في المجموعات التالية: مجموعة التحكم ، مجموعة دوكسوروبيسين هيدروكلوريد (DXR ، 5 ميكرومتر) ، ومجموعات سال (20 ميكرومتر ، 40 ميكرومتر ، و 80 ميكرومتر) ، أو مجموعة التحكم ، LY294002 (10 ميكرومتر ، مثبط ل PI3K) ، مجموعة Sal (80 ميكرومتر) ، ومجموعة LY294002 (10 ميكرومتر) + سال (80 ميكرومتر) (انظر جدول المواد).</li>
</ol>2. فحص صلاحية الخلية
ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول هذا الإجراء، يرجى الرجوع إلى تقرير سابق27.
<ol><li>خلايا البذور MCF-7 بكثافة 8 × 104 خلايا / بئر في 96 لوحة بئر ، واحتضانها مع Sal (10 ميكرومتر ، 20 ميكرومتر ، 40 ميكرومتر ، 80 ميكرومتر ، 160 ميكرومتر ، و 320 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة أو سال (20 ، 40 ، 80 ميكرومتر) لمدة 12 ساعة / 24 ساعة / 36 ساعة / 48 ساعة طوال الليل حتى تلتصق الخلايا.</li>
	<li>بعد العلاج ، شارك في احتضان خلايا MCF-7 ب 10 ميكرولتر / بئر من محلول CCK-8 (انظر جدول المواد) لمدة 2 ساعة. بعد ذلك ، قم بقياس الكثافة الضوئية عند 450 نانومتر (OD450) باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة التلقائي.</li>
</ol>3. هجرة الخلايا والغزو
ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول هذا الإجراء، يرجى الرجوع إلى تقرير سابق35.
<ol><li>احتضان 2 مل من 5 × 106 خلايا / مل خلايا مصنفة في 6 آبار لتغطية 90٪ من قاع الطبق.</li>
	<li>قم بإجراء جرح خدش خطي على طول مركز الطبقة الأحادية للخلية باستخدام طرف ماصة معقم. التقط الصور باستخدام المجهر الضوئي عند 0 ساعة و 24 ساعة و 48 ساعة.</li>
	<li>استخدم برنامج Image J لقياس عرض جروح الخدش.</li>
	<li>بالنسبة لمقايسة السيرسويل ، قم بتعليق خلايا MCF-7 بدون وسط مصل ، والبذور في غرفة الإرسال العلوية المطلية مسبقا ب Matrigel أو بدونه (انظر جدول المواد).</li>
	<li>في الجزء السفلي من غرفة transwell ، استخدم وسط DMEM الكامل كمحفز كيميائي. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الخلايا الموجودة في الغرفة العلوية ، وقم بإصلاح الخلايا الغازية والمهاجرة المتبقية في الميثانول35.</li>
	<li>قم بتلطيخ خلايا MCF-7 بمحلول بنفسجي بلوري (انظر جدول المواد). التقط الصور باستخدام المجهر الضوئي.</li>
</ol>4. تقييم نشاط Na + -K + -ATPase و Ca 2 + -Mg 2 + -ATPase
<ol><li>استخدم مجموعة حمض البيسينتشونينيك (BCA) لقياس تركيز البروتين في خلايا MCF-7 المحللة ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).<ol><li>أضف عينات من الخلايا المحللة في مجموعاتها المقابلة في لوحات 96 بئرا. بعد ذلك ، أضف محلول العمل لمزيد من الاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أخيرا ، قم بقياس قيم OD636 باستخدام قارئ microplate متعدد الوظائف.</li>
	</ol></li>
</ol>5. تحليل التدفق الخلوي لموت الخلايا المبرمج ودورة الخلية
ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول هذا الإجراء، يرجى الرجوع إلى تقرير سابق31.
<ol><li>هضم الخلايا ، والحصاد لإعادة تعليقها في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة 20 دقيقة تلطيخ مع الملحق V-FITC ويوديد البروبيديوم (PI) (انظر جدول المواد) ، ثم حدد عدد الخلايا المبرمج باستخدام مقياس التدفق الخلوي.</li>
	<li>امزج محلول العينة المعاد تعليقه مع محلول PI لمدة 30 دقيقة حضانة ، متبوعا بالكشف باستخدام مقياس التدفق الخلوي.</li>
</ol>6. DCFH-DA و Fluo-4 AM تلطيخ مضان
ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول هذا الإجراء، يرجى الرجوع إلى تقرير سابق29.
<ol><li>احتضان خلايا MCF-7 لمدة 20 دقيقة باستخدام مسبار مضان DCFH-DA 10 ميكرومتر (انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية. بعد إزالة الفائض DCFH-DA تماما عن طريق الغسيل ثلاث مرات باستخدام PBS ، اختبر شدة التألق عند الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث البالغة 488 نانومتر و 525 نانومتر ، على التوالي ، باستخدام مجهر مضان.</li>
	<li>احتضان خلايا MCF-7 بمحلول مسبار فلوري 5 ميكرومتر Fluo-4 AM (انظر جدول المواد) لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الغسيل باستخدام PBS ثلاث مرات ، حدد قيم شدة التألق عند الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث البالغة 488 نانومتر و 516 نانومتر ، على التوالي ، باستخدام مجهر مضان.</li>
</ol>7. لطخة الغربية
<ol><li>أضف 2 مل من 5 × 106 خلايا / معلقات خلايا مل تحتوي على أدوية مختلفة في ألواح 6 آبار ، واستزراع في حاضنة CO 2 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة. ملاحظة: تم تحديد مجموعات تحليل اللطخة الغربية على النحو التالي: مجموعة التحكم ، مجموعة LY294002 (10 ميكرومتر) ، مجموعة سال (80 ميكرومتر) ، ومجموعة LY294002 (10 ميكرومتر) + سال (80 ميكرومتر) (انظر جدول المواد).</li>
	<li>جمع الخلايا والطافات ، وأجهزة الطرد المركزي في 560 × غرام في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. تخلص من المادة الطافية واغسلها مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني مبرد مسبقا. بعد كل غسلة ، قم بطرد الخلايا عند 560 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق.</li>
	<li>أضف 50 ميكرولتر من محلول التحلل إلى عينة الخلية من الخطوة 7.2 لحمام جليدي لمدة 15 دقيقة. جهاز طرد مركزي عند 8550 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق لجمع عينة البروتين الطافية.</li>
	<li>بعد اكتشاف تركيز البروتين باستخدام طريقة BCA ، امزج عينة البروتين في الخطوة 7.3 مع مخزن التحميل بنسبة 4: 1 ، وتشوه عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في حمام معدني ، ثم تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>أضف 20 ميكروغرام من عينة البروتين من الخطوة 7.4 ، وافصل البروتينات ذات الأوزان الجزيئية المختلفة35باستخدام 10٪ SDS-PAGE (انظر جدول المواد) ، ثم انقلها إلى أغشية PVDF 0.22 ميكرومتر. بعد الانسداد باستخدام 5٪ BSA ، احتضان الأغشية بالأجسام المضادة الأولية المقابلة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. ملاحظة: التركيز المخفف للأجسام المضادة الأولية التالية هو 1: 1000: كاسباز مشقوق -9/7/3 (CC-9/7/3) ، بيم ، باكس ، Bcl-2 ، p-PI3K / PI3K ، p-AKT / AKT ، mTOR ، HIF-1α ، FoxO1 ، و β-actin (انظر جدول المواد).</li>
	<li>في اليوم التالي ، احتضان الأغشية بالجسم المضاد الثانوي IgG المضاد للأرانب لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. تطوير الأغشية باستخدام محلول ECL كيميائي ، والتقاط الصور باستخدام نظام تصوير اللطخة الغربية الكمية بدون تلامس (انظر جدول المواد).</li>
</ol>8. qRT-PCR
<ol><li>قم بإجراء الطرد المركزي لجمع خلايا MCF-7 عند 560 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق ، وإضافة 500 ميكرولتر عازلة RL1 إلى 5 × 106 خلايا. تهب وتخلط بشكل متكرر مع ماصة حتى لا تكون كتل الخلايا مرئية. ملاحظة: يعد Buffer RL1 أحد المكونات الموجودة في مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلي (انظر جدول المواد).</li>
	<li>انقل متجانسات الخلايا في الخطوة 8.1 إلى عمود تنظيف الحمض النووي المضمن في أنبوب التجميع ، وأجهزة الطرد المركزي عند 8550 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين. قم بإزالة عمود تنظيف الحمض النووي ، واحتفظ بالمادة الطافية في أنبوب التجميع. ملاحظة: عمود تنظيف الحمض النووي وأنبوب التجميع هما مكونان في مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلية (انظر جدول المواد).</li>
	<li>أضف 800 ميكرولتر عازلة RL2 إلى 500 ميكرولتر من المادة الطافية من الخطوة 8.2 ، واخلطها برفق. ملاحظة: يعد Buffer RL2 أحد المكونات الموجودة في مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلي (انظر جدول المواد). أضف 120 مل من الإيثانول اللامائي إلى 60 مل من المخزن المؤقت RL2 قبل الاستخدام.</li>
	<li>انقل 700 ميكرولتر من الخليط من الخطوة 8.3 إلى عمود الحمض النووي الريبي فقط المضمن في أنبوب التجميع ، وأجهزة الطرد المركزي عند 8550 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 دقيقة. تخلص من سائل النفايات في أنبوب التجميع. ملاحظة: عمود الحمض النووي الريبي فقط هو أحد المكونات في مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلي (انظر جدول المواد).</li>
	<li>كرر الخطوة 8.4 لمعالجة الخليط المتبقي من الخطوة 8.3.</li>
	<li>أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت RW1 إلى عمود الحمض النووي الريبي فقط ، وأجهزة الطرد المركزي عند 8550 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. تخلص من سائل النفايات في أنبوب التجميع. ملاحظة: المخزن المؤقت RW1 هو أحد المكونات في مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلي (انظر جدول المواد).</li>
	<li>أضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت RW2 إلى عمود الحمض النووي الريبي فقط ، وأجهزة الطرد المركزي عند 8550 × جم عند 4 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. تخلص من سائل النفايات في أنبوب التجميع. كرر الخطوة 8.7 مرة واحدة. ملاحظة: يعد Buffer RW2 أحد المكونات في مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلي (انظر جدول المواد).</li>
	<li>ضع عمود الحمض النووي الريبي فقط مرة أخرى في أنبوب التجميع ، وأجهزة الطرد المركزي عند 8550 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين لإزالة المخزن المؤقت المتبقي RW2.</li>
	<li>انقل عمود الحمض النووي الريبي فقط إلى أنبوب تجميع جديد ، وقم بتقطير 100 ميكرولتر من ddH2O الخالي من RNase المسخن مسبقا عند 65 درجة مئوية في مركز الغشاء لعمود الحمض النووي الريبي فقط. ضع في 25 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، وجمع محلول الحمض النووي الريبي عن طريق الطرد المركزي عند 8550 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 دقيقة. ملاحظة: DDH2O الخالي من RNase هو أحد المكونات في مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلي (انظر جدول المواد).</li>
	<li>أضف 4 ميكرولتر من محلول تفاعل 5x ، و 1 ميكرولتر من أوليجو (dT) 18 التمهيدي ، و 1 ميكرولتر من التمهيدي السداسي العشوائي ، و 1 ميكرولتر من التمهيدي الخاص بالجينات (انظر الجدول 1) ، و 1 ميكرولتر من مزيج الإنزيم ، و 5 ميكروغرام من محلول الحمض النووي الريبي من الخطوة 8.9 إلى شريط 100 ميكرولتر 8 أنابيب. استكمل نظام التفاعل بالماء الخالي من RNase إلى 20 ميكرولتر.</li>
	<li>اضبط شروط تفاعل النظام على النحو التالي: (1): 95 °C ، 30 ثانية ، دورة واحدة ؛ (2): 95 درجة مئوية ، 5 ثوان ، 50 دورة ، 60 درجة مئوية ، 34 ثانية ؛ (3): 95 °C ، 5 s ، 1 دورة ، 65 °C ، 60 ثانية ، 97 °C ، 1 ثانية ؛ و (4): 42 درجة مئوية ، 30 ثانية ، 1 دورة. تنفيذ إجراء qRT-PCR. ملاحظة: تم تحليل مستويات التعبير النسبية للجينات المستهدفة كميا بواسطة طريقة 2−ΔΔCT 36,37. يتم سرد المعلومات الأولية لكل جين مستخدم لتحليل qRT-PCR في الجدول 1.</li>
</ol>9. التحليل الإحصائي
<ol><li>التعبير عن البيانات في صورة متوسط الانحراف المعياري ± لثلاث تجارب مستقلة.</li>
	<li>قم بتحليل المقارنات بين مجموعات متعددة باستخدام برنامج الرسوم البيانية والتحليل (انظر جدول المواد) مع تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعا باختبار Tukey. في هذا العمل ، تم تعريف P < 0.05 على أنه ذو دلالة إحصائية.</li>
</ol>

آلية ساليدروسيد في قمع هجرة خلايا MCF-7 وانتشارها

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يصيب سرطان الثدي الأفراد من جميع الأعمار ويسبب عبئا جسديا وعقليا لا يحصى وضغطا اقتصاديا كبيرا1. كما اجتذب سرطان الثدي ، مع زيادة معدلات المراضة والوفيات كل عام ، اهتماما عالميا من حيث البحث عن علاجات مركبة عشبية فعالة تتجاوز العلاجات التقليدية 4,5</...

كواحد من أكثر أنواع السرطان التي يتم تشخيصها شيوعا والأورام الخبيثة الأكثر شيوعا ، تشير أحدث الإحصاءات إلى ظهور 2.3 مليون حالة من سرطان الثدي حول العالم بحلول عام 2020 ، وهو ما يمثل 11.7٪ من جميع حالات السرطان1. تشمل الأعراض الشائعة لسرطان الثدي إيلام الثدي وخزه ، وكتل الثدي والألم ، وإفرازات الحلمة ، وتآكل الجلد أو غائرته ، وتضخم الغدد الليمفاوية الإبطية 1,2. والأمر الأكثر إثارة للقلق هو أن عدد الحالات الجديدة ومعدل الإصابة الإجمالي بسرطان الثدي مستمران في الزيادة بمعدل هائل كل عام ، وهو ما يمثل 6.9٪ من الوفيات المرتبطة بالسرطان1. في الوقت الحاضر ، لا يزال التدخل في سرطان الثدي ينطوي بشكل أساسي على العلاج الكيميائي والجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الشامل. على الرغم من أن العلاج يمكن أن يقلل بشكل فعال من معدل التكرار ومعدل وفيات المرضى ، إلا أن تطبيق العلاج على المدى الطويل غالبا ما يسبب مقاومة للأدوية المتعددة ، وتساقط الشعر في منطقة كبيرة ، والغثيان والقيء ، وعبء عقلي خطير 2,3. والجدير بالذكر أن الخطر المحتمل لنقائل الأعضاء المتعددة من سرطان الثدي يجبر الناس أيضا على البحث عن مصادر عشبية جديدة للعلاج الدوائي 4,5.
الإشارات بوساطة فوسفوينوسيتيد 3 كيناز (PI3K) متورطة في نمو سرطان الثدي وتكاثره وبقائه على قيد الحياة من خلال الربط الذي يؤثر على التعبير عن جينات متعددة6. كبروتين استشعار إشارة المصب من PI3K ، تشير العديد من الأدلة إلى أن بروتين كيناز B (AKT) يمكن أن يقترن بهدف الثدييات لبروتين rapamycin (mTOR) لزيادة سرطان الثدي7،8،9. علاوة على ذلك ، زعم أيضا أن إلغاء تنشيط إشارات PI3K / AKT / mTOR هو عنصر رئيسي في الأدوية التي تثبط الانتشار الخبيث وتحفز موت الخلايا المبرمج في سرطان الثدي10،11،12. من المعروف أن نقص الأكسجة الشديد في البيئة المكروية للورم يفرض زيادة هائلة في العامل 1 ألفا المحرض على نقص الأكسجة (HIF-1α) ، مما يزيد من تفاقم تطور سرطان الثدي13،14،15. في موازاة ذلك ، يؤدي تحفيز AKT أيضا إلى تراكم مفرط ل HIF-1α ، مما يحد من موت الخلايا المبرمج في عينات سرطان الثدي16,17. ومن المثير للاهتمام ، أن تنشيط إشارات PI3K-AKT-HIF-1α قد تم تأكيده للمشاركة في التقدم المرضي وورم خبيث في مجموعة متنوعة من السرطانات ، بما في ذلك سرطان الرئة18 وسرطان القولون والمستقيم19 وسرطان المبيض20 وسرطان البروستاتا21. بالإضافة إلى تنسيقه بواسطة HIF-1α ، يتم أيضا تشغيل التعبير المفرط لعامل نسخ الرأس المتشعب 1 (FoxO1) عن طريق تحفيز إشارات AKT ، مما يعزز توقف الدورة وتثبيط موت الخلايا المبرمج في خلايا سرطان الثدي22,23. معا ، تشير الأدلة القوية المذكورة أعلاه إلى أن تثبيط سلسلة إشارات PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 قد يكون هدفا جديدا محتملا للعلاج الدوائي في سرطان الثدي.
ثبت على نطاق واسع أن Salidroside (Sal) يمارس أنشطة مضادة للسرطان24،25 ، ومضاد لنقص الأكسجة 26،27،28،29 ، والأنشطة الدوائية المعززة للمناعة30. إنه مسحوق بني فاتح أو بني قابل للذوبان في الماء بسهولة ، وهو نوع من جليكوسيد phenylethanoid ، وله صيغة بنية كيميائية من C14H 20 O7 ووزن جزيئي300.331,32. أظهرت التحقيقات الدوائية الحديثة أن Sal يمكن أن يعزز موت الخلايا المبرمج لخلايا سرطان المعدة عن طريق تقييد إشارات PI3K-AKT-mTOR24. تشير أدلة أخرى أيضا إلى أن قمع إشارات PI3K-AKT-HIF-1α بواسطة علاج Sal قد يساهم في موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية من خلال تعزيز حساسيتها لعوامل العلاج الكيميائي25. تشير الدلائل أيضا إلى أن Sal يقيد هجرة الخلايا وغزوها ويسبب توقف الدورة من خلال تعزيز موت الخلايا المبرمج في خلايا سرطان الثدي البشري MCF-733,34. ومع ذلك ، يبقى أن نرى ما إذا كان بإمكان Sal تنظيم إشارات PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 وتمنع الانتشار الخبيث لخلايا MCF-7. لذلك ، يهدف هذا البروتوكول إلى استكشاف تأثيرات Sal على هجرة خلايا MCF-7 ، والغزو ، ودورة الخلية ، وموت الخلايا المبرمج عبر مسار PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. يمكن أن توفر استراتيجيات البحث المتكاملة التي تضم تجارب تقليدية ومنخفضة التكلفة ومستقلة ، مثل تقييمات هجرة الخلايا والغزو ، وموت الخلايا المبرمج واكتشاف دورة الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وتحديد مضان الكالسيوم2+ ، وما إلى ذلك ، مرجعا للتصميم العام لتجارب أبحاث مكافحة السرطان مع الأدوية العشبية التقليدية. العملية التجريبية لهذه الدراسة موضحة في الشكل 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% penicillin/streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YT0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC/PI kit</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>AP101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax iD5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bax antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#5023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL521A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl-2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#15071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bim antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+&#8211;ATPase assay kit</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A070-4-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting kit-8</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BS350B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell cycle staining kit</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>CCS012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-3</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-7</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#8438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-9</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#20750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose culture medium</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-15142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL chemiluminescent solution</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL520B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Procell Life Science &#38; Technology Co., Ltd.</td>
			<td>164210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65634/65634eq01.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>S1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FoxO1 antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YT1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>70-GAR0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software</td>
			<td>La Jolla</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIF-1&#945; antibody</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>BF8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human breast cancer cell line MCF-7</td>
			<td>Procell Life Science &#38; Technology Co., Ltd.</td>
			<td>CL-0149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading buffer</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL502B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY294002</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTOR antibody</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>GB11405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+&#8211;K+&#8211;ATPase assay kit</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A070-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3K antibody</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>GB11525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-PI3K antibody</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>AF3241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative western blot imaging system</td>
			<td>Touch Image Pro</td>
			<td>eBlot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G3330-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROS assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>S0033S</td>
			<td>DCFH-DA fluorescence probe is included here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salidroside</td>
			<td>Chengdu Herbpurify Co., Ltd.</td>
			<td>H-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE kit</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G2003-50T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total RNA isolation kit</td>
			<td>Foregene</td>
			<td>RE-03014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>AF7018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the pharmacological action and molecular mechanism of salidroside in inhibiting mcf-7 cell proliferation and migration

يحتوي Salidroside (Sal) على أنشطة دوائية مضادة للسرطان ومضادة لنقص الأكسجين ومضادة للالتهابات. ومع ذلك ، فقد تم توضيح آلياته الأساسية المضادة لسرطان الثدي بشكل غير كامل. ومن ثم ، يهدف هذا البروتوكول إلى فك تشفير إمكانات Sal في تنظيم مسار PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 في الانتشار الخبيث لخلايا سرطان الثدي البشري MCF-7. أولا ، تم تقييم النشاط الدوائي ل Sal ضد MCF-7 بواسطة CCK-8 ومقايسات خدش الخلية. علاوة على ذلك ، تم قياس مقاومة خلايا MCF-7 عن طريق مقايسات الهجرة وغزو Matrigel. بالنسبة لموت الخلايا المبرمج ومقايسات الدورة ، تمت معالجة خلايا MCF-7 في خطوات مع الملحق V-FITC / PI ومجموعات الكشف عن تلطيخ دورة الخلية لتحليلات قياس التدفق الخلوي ، على التوالي. تم فحص مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) و Ca2+ بواسطة DCFH-DA و Fluo-4 AM تلطيخ المناعي. تم تحديد أنشطة Na + -K + -ATPase و Ca2 + -ATPase باستخدام المجموعات التجارية المقابلة. تم تحديد مستويات البروتين والتعبير الجيني في موت الخلايا المبرمج ومسار PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 باستخدام تحليلات اللطخة الغربية و qRT-PCR ، على التوالي. وجدنا أن علاج سال حد بشكل كبير من انتشار وهجرة وغزو خلايا MCF-7 ذات التأثيرات المعتمدة على الجرعة. وفي الوقت نفسه ، أجبرت إدارة سال أيضا خلايا MCF-7 بشكل كبير على الخضوع لموت الخلايا المبرمج وإيقاف دورة الخلية. أظهرت اختبارات التألق المناعي أن سال حفز بشكل ملحوظ إنتاج ROS و Ca2+ في خلايا MCF-7. أكدت بيانات أخرى أن سال عزز مستويات التعبير عن البروتينات المؤيدة لموت الخلايا المبرمج ، باكس ، بيم ، كاسباز المشقوق -9/7/3 ، والجينات المقابلة لها. باستمرار ، قلل تدخل سال بشكل بارز من التعبير عن بروتينات Bcl-2 و p-PI3K / PI3K و p-AKT / AKT و mTOR و HIF-1α و FoxO1 والجينات المقابلة لها. في الختام ، يمكن استخدام Sal كمركب مشتق من الأعشاب لعلاج سرطان الثدي ، لأنه قد يقلل من الانتشار الخبيث والهجرة وغزو خلايا MCF-7 عن طريق تثبيط مسار PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

As one of the most commonly diagnosed cancers and most common malignancies, the latest statistics indicate that 2.3 million cases of breast cancer emerged around the world by 2020, accounting for 11.7% of all cancer cases1. Common symptoms of breast cancer include breast tenderness and tingling, breast lumps and pain, nipple discharge, erosion or sunken skin, and enlarged axillary lymph nodes1,2. Even more alarming, the number of new cases and the overall incidence of breast cancer continues to increase at an overwhelming rate each year, accounting for 6.9% of cancer-related deaths1. At present, breast cancer intervention still mainly involves chemotherapy, surgery, radiotherapy, and comprehensive treatment. Although treatment can effectively reduce the recurrence rate and mortality rate of patients, long-term treatment application often causes produce multidrug resistance, large-area hair loss, nausea and vomiting, and serious mental and psychological burden2,3. Notably, the potential risk of multiple organ metastases from breast cancer also forces people to seek novel herbal sources of drug therapy4,5.
Phosphoinositide 3 kinase (PI3K)-mediated signaling is implicated in the growth, proliferation, and survival of breast cancer through splicing that affects the expression of multiple genes6. As a downstream signal-sensing protein of PI3K, numerous evidence suggests that protein kinase B (AKT) could couple with the mammalian target of rapamycin (mTOR) protein to further increase breast cancer7,8,9. Moreover, the deactivation of PI3K/AKT/mTOR signaling has also been claimed to be a key component in drugs inhibiting malignant proliferation and stimulating apoptosis in breast cancer10,11,12. It is well known that extreme hypoxia in the tumor microenvironment forces a massive surge in hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1&#945;), which further worsens the progression of breast cancer13,14,15. In parallel, AKT stimulation also leads to excessive accumulation of HIF-1&#945;, limiting apoptosis in breast cancer samples16,17. Interestingly, the activation of PI3K-AKT-HIF-1&#945; signaling has been confirmed to be involved in pathologic progression and metastasis in a variety of cancers, including lung cancer18, colorectal cancer19, ovarian cancer20, and prostate cancer21. In addition to being orchestrated by HIF-1&#945;, forked head transcription factor 1 (FoxO1) overexpression is also triggered by AKT signaling stimulation, which promotes cycle arrest and the inhibition of apoptosis in breast cancer cells22,23. Together, the above solid evidence suggests that the inhibition of the cascade of PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 signaling may be a potential novel target for drug therapy in breast cancer.
Salidroside (Sal) has been widely demonstrated to exert anti-cancer24,25, anti-hypoxia26,27,28,29, and immune-enhancing pharmacological activities30. It is a light brown or brown powder that is easily soluble in water, is a type of phenylethanoid glycoside, and has a chemical structure formula of C14H20O7 and a molecular weight of 300.331,32. Modern pharmacological investigations have demonstrated that Sal can promote the apoptosis of gastric cancer cells by restraining PI3K-AKT-mTOR signaling24. Further evidence also suggests that the suppression of PI3K-AKT-HIF-1&#945; signaling by Sal treatment may contribute to the apoptosis of cancer cells by enhancing their sensitivity to chemotherapeutic agents25. Evidence also suggests that Sal restricts cell migration and invasion and causes cycle arrest by promoting apoptosis in the human breast cancer MCF-7 cells33,34. However, it remains to be seen whether Sal can regulate PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 signaling and inhibit the malignant proliferation of MCF-7 cells. Therefore, this protocol aimed to explore the effects of Sal on MCF-7 cell migration, invasion, cell cycle, and apoptosis via the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway. The integrated research strategies comprising conventional, low-cost, and independent experiments, such as cell migration and invasion assessments, apoptosis and cell cycle detection by flow cytometry, reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ fluorescence determination, etc., can provide a reference for the overall design of experiments for anti-cancer research with traditional herbal medicine. The experimental process of this study is shown in Figure 1.

تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف الآليات الجزيئية لساليدروسيد في علاج سرطان الثدي 

استكشاف العمل الدوائي والآلية الجزيئية للساليدروسيد في تثبيط تكاثر خلايا MCF-7 وهجرتها

We focus on exploring active compounds derived from natural products and their potential in treating breast cancer. So specifically we aim to elucidate the pharmacologic effects of salidroside and its molecular mechanisms in combining breast cancer. Currently, reliable experimental techniques are lacking to validate salidroside's molecular targets in treating breast cancer.One significant finding in the field is a potential molecular mechanism of salidroside in enhancing the proliferation and migration of MCF7 cells through the regulation of PI3K/AKT/HIF-1 alpha/FoxO1 signaling. The laboratory's future research directly is to explore the pathophysiological mechanisms underlying breast cancer onset, development, prognosis and outcome. Additionally, we screen for active small molecular drugs derived from natural sources that may add in breast cancer prevention and treatment.

آثار سال على تثبيط الانتشار الزائد وتأخير التئام الجروح في خلايا MCF-7 للتحقق من إمكانات Sal ضد سرطان الثدي ، اختبرنا أولا خصائصه المضادة للسرطان باستخدام سمية تكاثر الخلايا وفحوصات الخدش لخط خلايا سرطان الثدي البشري MCF-7. تم تحضين هذه الخلايا بشكل مشترك مع سلسلة تركيز من Sal (5-320 μM) ل?...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Salidroside's Molecular Mechanisms in Breast Cancer Treatment at JoVE.com

يصف هذا البروتوكول استراتيجية شاملة لتقييم العمل الدوائي وآلية الساليدروسيد في تثبيط تكاثر خلايا MCF-7 وهجرتها.

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer ...

نحن نركز على استكشاف المركبات النشطة المشتقة من المنتجات الطبيعية وإمكاناتها في علاج سرطان الثدي. لذلك نهدف على وجه التحديد إلى توضيح التأثيرات الدوائية للساليدروسيد وآلياته الجزيئية في الجمع بين سرطان الثدي. حاليا ، تفتقر التقنيات التجريبية الموثوقة للتحقق من صحة الأهداف الجزيئية للساليدروسيد في علاج سرطان الثدي.أحد النتائج المهمة في هذا المجال هو الآلية الجزيئية المحتملة للساليدروسيد في تعزيز تكاثر وهجرة خلايا MCF7 من خلال تنظيم إشارات PI3K / AKT / HIF-1 alpha / FoxO1. تتمثل الأبحاث المستقبلية للمختبر بشكل مباشر في استكشاف الآليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة وراء ظهور سرطان الثدي وتطوره وتشخيصه ونتائجه. بالإضافة إلى ذلك ، نقوم بفحص الأدوية الجزيئية الصغيرة النشطة المشتقة من المصادر الطبيعية التي قد تضيف في الوقاية من سرطان الثدي وعلاجه.

exploring-pharmacological-action-molecular-mechanism-salidroside

Research

JoVE Journal

Medicine

Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration

915 Views.  Suining Central Hospital. نحن نركز على استكشاف المركبات النشطة المشتقة من المنتجات الطبيعية وإمكاناتها في علاج سرطان الثدي. لذلك نهدف على وجه التحديد إلى توضيح التأثيرات الدوائية للساليدروسيد وآلياته الجزيئية في الجمع بين سرطان الثدي. حاليا ، تفتقر التقنيات التجريبية الموثوقة للتحقق من صحة الأهد...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف الآليات الجزيئية لساليدروسيد في علاج سرطان الثدي 

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer mechanisms have been only incompletely elucidated. Hence, this protocol intended to decode the potential of Sal in regulating the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway in the malignant proliferation of human breast cancer MCF-7 cells. First, the pharmacological activity of Sal against MCF-7 was evaluated by CCK-8 and cell scratch assays. Moreover, the resistance of MCF-7 cells was measured by migration and Matrigel invasion assays. For cell apoptosis and cycle assays, MCF-7 cells were processed in steps with annexin V-FITC/PI and cell cycle-staining detection kits for flow cytometry analyses, respectively. The levels of reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ were examined by DCFH-DA and Fluo-4 AM immunofluorescence staining. The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were determined using the corresponding commercial kits. The protein and gene expression levels in apoptosis and the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway were further determined using western blot and qRT-PCR analyses, respectively. We found that Sal treatment significantly restricted the proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells with dose-dependent effects. Meanwhile, Sal administration also dramatically forced MCF-7 cells to undergo apoptosis and cell cycle arrest. The immunofluorescence tests showed that Sal observably stimulated ROS and Ca2+ production in MCF-7 cells. Further data confirmed that Sal promoted the expression levels of pro-apoptotic proteins, Bax, Bim, cleaved caspase-9/7/3, and their corresponding genes. Consistently, Sal intervention prominently reduced the expression of the Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1&#945;, and FoxO1 proteins and their corresponding genes. In conclusion, Sal can be used as a potential herb-derived compound for treating breast cancer, as it may reduce the malignant proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells by inhibiting the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway.

The present protocol describesa comprehensive strategy for evaluating the pharmacological action and mechanism of salidroside in inhibiting MCF-7 cell proliferation and migration.

Evaluating the Migration and Invasion of Salidroside Treated MCF-7 Cells in a Wound Scratch Assay

To begin, incubate two milliliters of the cultured MCF-7 cells in a six-well plate until 90%confluency. In the grown cell monolayer, create a linear scratch wound down the center using a sterile pipette tip. Then capture the images with an optical microscope at different time intervals.For the transwell assay, suspend MCF-7 cells in a serum-free medium. Then see the cells in the upper transwell chamber, either pre-coded or non-coded with Matrigel. Add DMEM complete medium at the bottom of the transwell chamber to act as a chemical inducer.After 24 hours, remove the cells in the upper chamber and fix the remaining invasive and migrant cells using methanol. Stain the MCF-7 cells using crystal violet solution. Next, image the stained cells with an optical microscope.A dose dependent inhibitory effect of salidroside on cell proliferation was observed, with a 50%decline in cell vitality at 40 micromolar. Further, salidroside could inhibit the vitality of MCF-7 cells over time, with a 50%decrease in MCF-7 cell vitality after 24 hours of co-incubation. The wound-scratch assay showed an inhibitory effect for salidroside treatment on MCF-7 cells.Further, salidroside treatment significantly reduced the undesirable migration and invasion of MCF-7 cells.

تقييم هجرة وغزو خلايا MCF-7 المعالجة بالساليدروسيد في مقايسة خدش الجرح

Determining Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase Activity in Salidroside Treated MCF-7 Cells

Using a bicinchoninic acid kit, measure the protein concentration of lysed MCF-7 cells following the manufacturer's instructions. Add the lysed cell samples into the corresponding groups in a 96-well plate. Then, add the working solution and incubate at 37 degrees Celsius for five minutes.Finally, measure the optical density values at 636 nanometers in a functional microplate reader. Salidroside restricted the enzyme vitalities of sodium potassium ATPases and calcium ATPase, indicating its potential role in promoting mitochondrial dysfunction.

تحديد نشاط Na+-K+-ATPase و Ca 2+-mg2+-ATPase في خلايا MCF-7 المعالجة بالساليدروسيد

Flow Cytometry Analysis of Apoptosis and the Cell Cycle in Salidroside Treated MCF-7 Cells

To begin, harvest the trypsinized MCF7 cells. Next, stain the PBS suspended cells with an X in five of ITC, and propidium iodide, for 20 minutes. Then determine the number of apoptotic cells using a flow cytometer.For cell cycle analysis, mix the re-suspended cells with propidium iodide solution in a fresh tube, and incubate the mixture for 30 minutes. Then detect the sample using a flow cytometer. Salidroside increased the number of MCF7 cells in the early and late apoptotic stages.Meanwhile, compared with the control group, salidroside treatment also sharply increased the number of cells in the G0 G1 phase, while reducing the proportion of S phase cells.

تحليل التدفق الخلوي لموت الخلايا المبرمج ودورة الخلية في خلايا MCF-7 المعالجة بالساليدروسيد

DCFH-DA and Fluo-4 AM Fluorescence Staining of Salidroside Treated MCF-7 Cells

Add 10 micromolar of Dcfh-DA fluorescence probe to MCF7 cells and incubate at 37 degrees Celsius for 20 minutes. After incubation, remove the excess Dcfh-DA by washing the cells three times with PBS. Next, test the fluorescence intensity using a fluorescence microscope and an excitation wavelength of 488 nanometers, and an emission wavelength of 525 nanometers.Incubate the MC7 cells with a five micromolar Fluo-4 AM fluorescent probe solution for 45 minutes at 37 degrees Celsius. After washing the cells three times with PBS, determine the fluorescence intensity using a fluorescence microscope with excitation at 488 nanometers and emission at 516 nanometers. Salidroside significantly enhanced ROS fluorescence signals shown by Dcfh-DA immunofluorescent staining.Consistently, Salidroside intervention also distinctly elevated calcium production, evidenced by Fluo-4 AM immunofluorescent staining.

DCFH-DA و Fluo-4 AM تلطيخ مضان لخلايا MCF-7 المعالجة بالساليدروسيد

Analyzing Protein Expression in Salidroside Treated MCF-7 Cells by Western Blotting

Begin by adding two milliliters of MCF-7 cells containing different drugs into the wells of a six-well plate. Incubate the cell cultures for 24 hours at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. Harvest the cells by centrifugation at 560 x g for three minutes at four degrees Celsius.Then wash the cells twice with pre-cool PBS, centrifuging at 560 x g for three minutes between the washes. Add 50 microliters of lysis buffer to the washed cells and place the sample in an ice bath for 15 minutes. Then centrifuge the sample at 8, 550 x g for 10 minutes at four degrees Celsius, and collect the supernatant protein sample.Combine the protein sample with the loading buffer in a four to one ratio. Next, denature the mixture at 100 degrees Celsius for 10 minutes in a metal bath. Then cool the mixture at room temperature.Separate the protein sample using 10%SDS polyacrylamide gel electrophoresis. Transfer the proteins onto a 0.22 micrometer PVDF membrane. After blocking the membrane with 5%BSA, incubate it with the corresponding primary antibodies overnight at four degrees Celsius.The following day, incubate the membrane with goat anti-rabbit IgG secondary antibody at 37 degrees Celsius for two hours. Then develop the membranes using an ECL chemiluminescence solution and capture the images using a contactless quantitative Western blot imaging system. Western blot showed that salidroside treatment promoted the protein expression of the pro-apoptotic factors CC-9, CC-7, CC-3, Bim, and Bax while it inhibited the protein expression of anti-apoptotic BCL-2.Salidroside prominently limited the ratios of p-PI3K to PI3K and p-AKT to AKT. Meanwhile, the protein expression of mTOR, HIF-1 alpha, and Fox01 was also notably suppressed.

تحليل تعبير البروتين في خلايا MCF-7 المعالجة بالساليدروسيد بواسطة النشاف الغربي

Determining Gene Expression in Salidroside Treated MCF-7 Cells Using qRT-PCR

Harvest the MCF-7 cells by centrifugalization at 560-G for three minutes, at four degrees Celsius. Add 500 microliters of buffered RL-1 to five times 10 to the six cells and mix thoroughly until no cell masses are visible. Next, transfer the cell homogenates to a DNA cleaning column embedded in the collection tube.Centrifuge the samples at 85-50-G for two minutes, at four degrees Celsius. After centrifuging, remove the DNA cleaning column, retaining the supernatant in the collection tube. Add 800 microliters of buffer RL-2 and 500 microliters of the supernatant, and mix gently.Next, transfer 700 microliters of the mixture into an RNA-only column embedded in the collection tube. Centrifuge the tube at 8, 550-G for one minute, at four degrees Celsius. Then discard the flow-through in the collection tube.Wash the RNA-only column first with 500 milliliters of buffer RW-1, and then with 700 milliliters of buffer RW-2, by centrifuging for one minute at 8, 550-G, and four degrees Celsius at each wash. After removing the residual RW-2 by centrifuging again, transfer the RNA only column to a new collection tube. Add 100 microliters of RNAs-free deionized water, preheated at 65 degrees Celsius to the center of the membrane in the RNA-only column, and wait for two minutes.Then centrifuge at 8, 550-G for one minute, at four degrees Celsius to collect the RNA solution. Set up the reaction mixture for PCR and then set the PCR reaction conditions of the system. Execute the QRT PCR procedure.QRT PCR showed that cylindricity treatment promoted the gene expression of the pro-apoptotic factors, CC-9, CC-7, CC-3, vim, and vax, while it inhibited the gene expression of anti-apoptotic BCL-2. Further, cylindricide administration reduced the gene expression levels of PI-3K, AKT, M-tor, HIF1-Alpha and Fox-01.